副粘病毒融合蛋白分子上特异性细胞融合作用位点的初步确定

目的　找到副粘病毒融合蛋白 (F)分子上与血凝素 神经氨酸酶 (HN)相互作用的特异性区域 ,弄清F融合细胞的分子机理。方法　采用基因定点突变法 ,创造一个酶切位点 ,得到突变株 ,然后用基因重组的方法得到各种重组株 ,并于真核细胞内进行表达 ,Gimsa染色和指示基因法检测细胞融合功能 ,荧光强度分析 (FACS)检测表达效率情况。结果　在将各有关F基因片段进行交换之前 ,创造一个酶切位点时所得突变株的细胞融合功能与野毒株相同 ;将新城疫病毒 (NDV)F和副流感病毒 (PIV)F在膜穿入部分和躯干部分交接处交换时 ,不影响细胞融合功能 ;进一步将F2进行交换时 ,也不影响细胞融合功能 ;而将F的头部进行交换时 ,则检测不到细胞融合作用 ,FACS分析表明 ,F没有达到细胞表面。结论　F分子上与HN相互作用的特异性区域位于膜穿入部分和躯干部分交接处与F1和F2交接处之间 ,即F1除去膜穿入部分和尾部的剩余部分。     

副黏病毒F蛋白融合活性位点中病毒特异性氨基酸基因突变分析

目的 了解副黏病毒融合蛋白(F)融合活性位点中的病毒特异性氨基酸在细胞融合中的作用.方法 以新城疫病毒(NDV)和人副流感病毒(hPIV)为例,在已确定的F蛋白融合活性位点中对病毒特异性氨基酸进行定点突变,然后将突变体F基因与同源或异源的血凝素.神经氨酸酶(HN)基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达.Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率.结果 在NDV F的突变体中,N150D-L152D的融合功能达到野毒株的46.31%;而N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D和Q279E-Q281E的融合活性却几乎消失,分别只有野毒株的1.25%、3.14%和2.23%;N296D-N297D的融合功能是野毒株的97.68%.在hPIV F的突变体中,D143A-E145A的融合功能达到野毒株的32.63%;E223Q-K224A几乎不能形成合胞体,其融合活性只有野毒株的1.91%;K263A-R265A、D268A-D270A和R475A-R476A的融合功能分别是野毒株的14.63%、19.52%和28.95%.FACS结果表明,NDV F的N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D和Q279E-Q281E突变体及hPIVF的E223Q-K224A突变体F蛋白在细胞表面几乎没有表达;其余所有突变体F蛋白的表达效率与野毒株相比,基本不变.结论 对于NDV F来说,N257、N258、Q259、G271、N272、Q279、Q281对NDV F的特异性细胞融合功能起重要作用;N150和L152也起一定的作用,但是N296和N297却没有作用.对于hPIV F来说,E223和K224对hPIV F的特异性细胞融合功能起非常重要的作用;D143、E145、K263、R265、D268、D270、R475、R476的作用也很重要.     

04风疹病毒E2包膜糖蛋白亮氨酸突变对细胞融合的影响

目的探讨风疹病毒E2包膜糖蛋白中部分亮氨酸的突变对特异性细胞融合的影响。方法于E2蛋白中选取9个亮氨酸位点,采用基因定点突变的方法分别将其突变成丙氨酸,采用流式细胞术检测各突变株蛋白在细胞表面的表达效率,Giemsa染色法与指示基因法检测特异性细胞融合,血吸附实验检测其吸附活性。结果与野毒株蛋白相比,除L144A与L225A之外,其它突变株蛋白在细胞表面的表达效率均有不同程度的降低。排除各突变株蛋白在细胞表面表达效率变化的影响后,其引起的细胞融合效率均有不同程度的降低,其中位于E2蛋白氨基酸序列中间靠近氨基端的亮氨酸（L58、L105、L128与L144）突变时,其细胞融合效率降低更为明显,相应的血吸附效率也有所降低。结论E2蛋白中,其氨基酸序列中间靠近氨基端的蛋白区域（L58～L144）对引起的特异性细胞融合具有重要的作用。     

副黏病毒F蛋白融合活性位点中病毒特异性氨基酸基因突变分析

目的 了解副黏病毒融合蛋白(F)融合活性位点中的病毒特异性氨基酸在细胞融合中的作用.方法 以新城疫病毒(NDV)和人副流感病毒(hPIV)为例,在已确定的F蛋白融合活性位点中对病毒特异性氨基酸进行定点突变,然后将突变体F基因与同源或异源的血凝素.神经氨酸酶(HN)基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达.Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率.结果 在NDV F的突变体中,N150D-L152D的融合功能达到野毒株的46.31%;而N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D和Q279E-Q281E的融合活性却几乎消失,分别只有野毒株的1.25%、3.14%和2.23%;N296D-N297D的融合功能是野毒株的97.68%.在hPIV F的突变体中,D143A-E145A的融合功能达到野毒株的32.63%;E223Q-K224A几乎不能形成合胞体,其融合活性只有野毒株的1.91%;K263A-R265A、D268A-D270A和R475A-R476A的融合功能分别是野毒株的14.63%、19.52%和28.95%.FACS结果表明,NDV F的N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D和Q279E-Q281E突变体及hPIVF的E223Q-K224A突变体F蛋白在细胞表面几乎没有表达;其余所有突变体F蛋白的表达效率与野毒株相比,基本不变.结论 对于NDV F来说,N257、N258、Q259、G271、N272、Q279、Q281对NDV F的特异性细胞融合功能起重要作用;N150和L152也起一定的作用,但是N296和N297却没有作用.对于hPIV F来说,E223和K224对hPIV F的特异性细胞融合功能起非常重要的作用;D143、E145、K263、R265、D268、D270、R475、R476的作用也很重要.     

兔视网膜脱离后出现神经感觉层细胞凋亡

目的:研究实验性视网膜脱离(retinal detachment,RD)及脱离复位后神经感觉层细胞凋亡情况,探讨RD后视功能损害的机制为临床治疗提供理论基础。方法:健康成年无眼部疾病青紫兰兔40只,采用计算机随机数字表法分为RD后1,3h;1,3,7,14,28d组及正常对照组,共8组,每组5只,选取右眼为致伤眼,视网膜下注射透明质酸钠建立RD模型;分别于建立模型后按时获取兔眼标本,以TUNEL法观察视网膜神经感觉层细胞的凋亡情况。结果:视网膜脱离复位后存在着神经感觉层细胞凋亡现象,正常对照组、14d和28d组几乎不见凋亡细胞,脱离后1,3h;3,7d组在视网膜各细胞层均出现较多的、具有凋亡形态学与生化改变特征的凋亡细胞,其中在3d组视网膜感觉层细胞凋亡细胞数量达到高峰。视网膜神经感觉层凋亡细胞数目在1,3h;3,7d组之间两两比较均有显著性差异(P<0.01);1,3h;3,7d组与正常对照组、1h;1,28d组之间两两比较均有显著性差异(P<0.01);正常对照组、1h;14,28d组之间两两比较无显著性差异。结论:RD复位后,神经感觉层细胞发生凋亡。     

山东省疾病预防控制机构检验能力分析

目的了解山东省疾病预防控制体系检验能力,查找不足,为疾控体系能力建设提供依据。方法应用专用调查表,对疾控体系三级疾病预防控制机构检验能力进行普查分析。结果按照国家省市县三级疾病预防控制机构检验能力标准,省级疾控机构检验能力拥有率为72.52%,市级52.09%,县级60.89%。检验能力标准规定各级必须开展的检验工作项目,只有29.41%的市级疾控机构和39.57%的县级疾控机构能够全部开展。结论全省疾控体系检验能力还不符合国家要求,市级、县级尤其是市级疾控机构检验能力差距还比较大,需要进一步提高检验能力。     

致癌病毒与肿瘤发生的因果关系

病毒不同于其它微生物,必须在活细胞内才能生长,被它侵入的细胞称为宿主细胞。病毒与宿主细胞的相互作用是矛盾对立的两个方面,肿瘤形成是二者相互作用的结果之一。致癌病毒使正常细胞转化为癌细胞,体现着复杂的因果关系。一、致癌病素与宿主细胞的相互作用病毒与细胞是矛盾对立的两个方面。它们之间的关系是对立统一的。病毒要保持种的延续,必须侵入细胞,借助于细胞作为病毒繁殖的场所,并利用细胞的酶、成分等合成自己本身所需的生物大分子即蛋白质、RNA或DNA,否则病毒将无法延续后代。在病毒感染细胞后,病毒作用于细胞,细胞对病毒也有反作用。那么病毒感染细胞后的结局是什么呢?(1)细胞对病毒非常敏感,病毒在细胞内大量繁殖并引起病变导致细胞死亡;(2)病毒     

复方丹参注射液治疗兔视网膜挫伤的实验研究

目的:研究复方丹参注射液(Danshen injection)在实验性兔视网膜挫伤时对视网膜细胞凋亡的干预作用。方法:青紫兰兔44只分为实验对照组和复方丹参注射液治疗组。以改良Allen’s重击法制备兔右眼挫伤性视网膜病变模型,两组在建立模型后1,3h;1,3,7,14,28d分别取眼球。另设立正常对照组2只青紫兰兔,不作任何处理,在实验观察结束时取眼球。采用原位末端标记法(TUNEL)和透射电子显微镜观察视网膜细胞凋亡情况,并进行细胞计数。结果:视网膜挫伤后存在着神经感觉层细胞凋亡现象。在实验对照组和复方丹参注射液组两组中,正常对照组、1h,28d组几乎不见凋亡细胞,挫伤后3h;1,3d组在视网膜各细胞层均出现较多的、具有凋亡形态学与生化改变特征的凋亡细胞,其中在3d组视网膜感觉层细胞凋亡细胞数量达到高峰。复方丹参注射液治疗组的凋亡细胞数比实验对照组少,有显著性差异(P<0.01)。结论:实验性视网膜挫伤中,复方丹参注射液治疗能抑制视网膜细胞凋亡的发生。     

大黄乙醇提取物体外抗麻疹病毒作用实验研究

目的：研究大黄乙醇提取物体外抗麻疹病毒的作用及其途径。方法采用组织细胞培养法,使用麻疹病毒野毒株、标准株和疫苗株,采用抗病毒生物合成组、直接杀灭组、预防作用组3种加药方式,在Vero‐SLAM细胞上观察大黄乙醇提取物抗麻疹病毒作用。结果大黄乙醇提取物在Vero‐SLAM 细胞上对不同来源的麻疹病毒株均具有明显的抗病毒生物合成和直接杀灭作用,药物的最小有效浓度（MIC ）为156μg／ml ,最大无毒浓度（0％ toxility concentration ,TC0）为5000μg／ml ,治疗指数（ TI ）为32。结论大黄乙醇提取物在体外对麻疹病毒具有显著抗病毒作用,安全性较高,应用前景广泛。     

不同免疫方案制备肠道病毒71型抗血清的免疫效果比较

目的比较不同免疫方案制备肠道病毒71型(EV71)抗血清的免疫效果,选择最佳免疫方案。方法制备EV71,并对病毒进行滴定和灭活。将BALB/c鼠随机分为5组,每组9只。1、2组以灭活病毒免疫,3、4组以活病毒免疫,1、3组的免疫间隔时间为2周,2、4组为3周,第5组为对照组,用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫,免疫间隔2周。免疫4次后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血清抗体滴度。结果 4个实验组均产生阳性抗体(A/A0≥2.1),对照组抗体阴性(A/A0<2.1),1～5组吸光度值依次为1.081 7±0.289 7、1.029 6±0.3719、1.074 8±0.374 9、1.492 9±0.215 9、0.168 7±0.021 8。对其进行单因素方差分析,F=23.449,P<0.05,差异有统计学意义,LSD-t检验结果,第4组与1、2、3组差异均有统计学意义(P<0.05),而1、2、3组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论各组抗体滴度不完全相同,其中第4组即活病毒间隔3周免疫组抗体滴度最高,所以活病毒间隔3周免疫方案可作为制得高滴度EV71抗血清的理想选择。