nPKC和cPKC调节骨骼肌葡萄糖转运体4型转位的研究

目的:探讨新颖型蛋白激酶C(nPKC)和传统型蛋白激酶C(cPKC)调节骨骼肌葡萄糖转运体4型(GLUT4)转位的作用.方法:C2C12GLUT4myc肌管分为Basal组、PMA组(PMA孵育)、Go6983+PMA组(Go6983预孵育,再与PMA共孵育)、G06976+PMA组(G06976预孵育,再与PMA共孵育)、PMA24 h+PMA组(PMA预孵育24 h后,PMA孵育)和PMA24 h+Go6976+PMA组(PMA预孵育24 h,Go6976预孵育后,Go6976和PMA共孵育),应用吸光度分析法测定细胞表面的GLUT4myc水平.结果:与Basal组相比,PMA组、G06976+PMA组、PMA24 h+PMA组细胞表面GLUT4myc转位明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),与PMA组相比,G06983+PMA组、G06976+PMA组、PMA24 h+PMA组和PMA24 h+Go6976+PMA组细胞表面GLUT4myc转位明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:PMA激活PKC,增强骨骼肌GLUT4转位;抑制nPKC或cPKC的活性可降低PMA刺激的骨骼肌GLUT4转位;激活nPKC或cPKC可调节骨骼肌GLUT4转位.     

Axin1调节骨骼肌GLUT4蛋白表达的作用研究

目的：探讨体轴发育抑制因子（Axin1）调节骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)蛋白表达的作用及其机制。方法：利用RNAi干扰的Axin1腺病毒（Ad-siAxin1）感染C2C12小鼠骨骼肌细胞敲低Axin1,荧光显微镜和MTS实验明确Ad-siAxin1最佳感染浓度和时间。分别用携带绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP）、Ad-siAxin1、载体质粒（vector）和Axin1质粒转染C2C12小鼠骨骼肌细胞敲低或过表达Axin1蛋白,Western印迹检测Axin1、端锚聚合酶蛋白（TNKS）和GLUT4蛋白水平。结果：荧光显微镜和MTS实验结果显示,在C2C12小鼠骨骼肌细胞中Ad-siAxin1作用的最佳浓度和时间分别为160μL和48 h。Western印迹结果显示,与Ad-GFP组相比,Ad-siAxin1组中Axin1蛋白降低（t=6.746,P<0.01）。Ad-siAxin1组TNKS蛋白水平降低（t=4.019,P<0.05）,GLUT4蛋白水平下调（t=3.248,P<0.05）。与vector组相比,转染Axin1质粒后,Axin1蛋白水平上...     

AMPK腺病毒载体在小鼠骨骼肌中的表达和作用

目的:探讨注射AMPK腺病毒在小鼠骨骼肌中的表达和作用。方法:C57BL/6小鼠随机分为4组:（1）无任何处理的空白对照组。（2）肌肉注射腺病毒空载体（Ad-GFP）组。（3）肌肉注射Ad-GFP,48 h后腹腔注射AMPK激活剂AICAR组。(4)肌肉注射GFP标记的激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）组。注射腺病毒72 h后,处死小鼠,通过小动物成像系统测定骨骼肌中的荧光强度,检测腺病毒的表达,用Western Blot方法检测ACC的磷酸化。结果:与空白对照组比较,注射腺病毒组的平均荧光强度显著增高。与病毒空载体组比较,注射AICAR组和Ad-AMPK-CA组的ACC磷酸化水平显著升高。结论:AMPK腺病毒能在小鼠骨骼肌中表达目的蛋白,调节AMPK的作用。     

二甲双胍通过调控MSTN抑制小鼠骨骼肌细胞C2C12分化

目的：探讨二甲双胍对小鼠骨骼肌细胞C2C12分化的影响及其分子机制。方法：将小鼠骨骼肌C2C12细胞系分为对照组和二甲双胍（5 mmol/L）组,用含5%马血清分化培养基诱导C2C12细胞分化,观察肌管形成情况。qPCR检测肌球蛋白重链（MyHC）和肌肉生长抑制素（MSTN）mRNA水平。Western印迹检测My HC、Ⅰ型肌球蛋白重链（MyHCⅠ）、Ⅱa型肌球蛋白重链（MyHCⅡa）、Ⅱb型肌球蛋白重链（MyHCⅡb）、Ⅱx型肌球蛋白重链（MyHCⅡx）和MSTN蛋白表达。应用siRNA下调MSTN的表达,并将小鼠骨骼肌C2C12细胞系分为MSTN敲低阴性对照组（siNC组）,MSTN敲低阴性对照+二甲双胍组（siNC+metformin组）,MSTN敲低组（siMSTN组）,MSTN敲低+二甲双胍组（siMSTN+metformin组）,检测二甲双胍是否通过升高MSTN抑制C2C12细胞分化。结果：显微镜观察显示,与对照组相比,二甲双胍组肌管数量减少、肌管直径较小。qPCR结果显示,与对照组相比,二甲双胍组My HC mRNA水平降低（t=29.47,P<0.000 1）,...     

氧化应激在糖尿病大鼠肌病中作用

目的 探讨氧化应激在糖尿病肌病发生发展中的作用。方法 尾静脉内注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。测定糖尿病不同时期股四头肌组织丙二醛含量和总超氧化物歧化酶活性。光镜下观察糖尿病不同时期股四头肌组织形态学的改变。结果 糖尿病大鼠1,3和6个月股四头肌组织丙二醛水平与同期对照组相比显著增高,分别为(1.81±0.30),(0.96±0.35),P<0.01;(1.14±0.20)(0.91±0.21),P<0.05;(1.32±0.29),(0.97±0.22),P<0.05。糖尿病大鼠1个月股四头肌组织总超氧化物歧化酶活性与对照组相比明显增高(47.43±6.23),(34.21±4.04),P<0.01,3个月时降至正常对照水平,6个月时明显降低(26.10±5.89),(32.67±5.56),P<0.05。组织形态学观察表明:糖尿病大鼠3个月时股四头肌出现病理改变,随着病程延长,病理改变越严重。结论 糖尿病大鼠早期股四头肌就已存在明显的氧化应激,氧化应激在糖尿病肌病的发生发展中起重要作用。     

巨噬细胞条件培养基对胰岛素调节骨骼肌细胞作用的影响

目的:探讨常氧和缺氧培养的巨噬细胞条件培养基对胰岛素调节骨骼肌葡萄糖转运子4(GLUT4)作用的影响。方法:常氧和缺氧培养巨噬细胞,提取条件培养基孵育C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞,用偶联抗体的吸光度法测定细胞膜上GLUT4myc的含量,Real-timePCR法测定巨噬细胞TNF-αmRNA的表达,ELISA法测定巨噬细胞条件培基中TNF-α的含量。结果:常氧和缺氧培养的巨噬细胞条件培养基削弱胰岛素刺激的骨骼肌细胞GLUT4myc转位(P<0.01),但两种条件培养基对骨骼肌中胰岛素作用的影响差异无统计学意义;缺氧培养的巨噬细胞TNF-αmRNA和蛋白表达均高于常氧培养的巨噬细胞(P<0.05或P<0.01)。结论:常氧培养和缺氧培养的巨噬细胞条件培养基均直接造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗,缺氧的巨噬细胞条件培养基并不能加重骨骼肌胰岛素抵抗。     

饱和脂肪酸对骨骼肌细胞胰岛素作用的影响及其机制研究

目的：探讨饱和脂肪酸是否造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗,并检测核糖体s6蛋白激酶（S6K）是否参与此机制。方法：将棕榈酸偶联到无脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）上,制备成浓度为5mmol／L的棕榈酸储存液,备用。棕榈酸组用0．5mmol／L的棕榈酸孵育16h;溶剂组用含相同浓度的无脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）孵育16h;对照组没有任何处理。用偶联抗体的吸光度分析法测定细胞膜上GLUT4myc的含量,免疫印迹检测胰岛素信号分子胰岛素受体底物（IRS1）、蛋白激酶B（Akt）和S6K的磷酸化水平。结果：与对照组和溶剂组相比,棕榈酸组胰岛素刺激的GLUT4myc转位降低（P〈0．05）;Akt的磷酸化水平降低,S6K的磷酸化水平没有变化,IRS1 S636／639的磷酸化水平也没有改变。结论：棕榈酸可导致骨骼肌细胞胰岛素抵抗,其机制可能不涉及S6K。     

BHMT基因rs3733890和rs7356530多态性与妊娠糖尿病患病风险的关系

目的:探讨甜菜碱同型半胱氨酸S甲基转移酶(BHMT)基因rs3733890和rs7356530多态性与妊娠糖尿病(GDM)患病风险的关系。方法:选取2019年12月至2022年4月在天津医科大学朱宪彝纪念医院做孕检、汉族、年龄21～40岁、妊娠24～28周的GDM孕妇80例,均经OGTT试验确诊。选择民族、年龄、孕周及孕前BMI相匹配的60名同期健康孕妇作对照。采集外周血,ELISA法检测血清Hcy、叶酸和维生素B12水平,Sanger测序法检测BHMT rs3733890和rs7356530多态性。采用Logistic回归分析GDM与两个多态性的关联。结果:GDM组血清Hcy和叶酸水平高于对照组(P<0.05)。GDM组BHMT rs3733890 A等位基因频率高于对照组,GA和AA基因型频率高于对照组(P<0.05)。两组BHMT rs7356530等位基因和基因型频率差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归分析结果显示,调整了年龄、孕前BMI、叶酸和维生素B12后,rs3733890 A等位基因与GDM患病风险增加有关,OR(95%CI)为2.6...     

聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛查胰岛素受体基因突变

目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（ＲＣＲＳＳＣＰ）和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择８９例非胰岛素依赖型糖尿病患者,ＰＣＲ扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子１７～２１）,进行ＳＳＣＰ电泳,银染色后,对突变样品进行序列分析。结果发现１１例外显子１７和１例外显子２０的异常电泳条带,外显子１７的突变经顺序分析,为ＣＡＣ１０５８→ＣＡＴ１０５８的杂合和纯合多态性突变。结论ＰＣＲＳＳＣＰ结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。