钠-氢交换蛋白1小干扰RNA对抗霉素A诱导人肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的保护机制

目的 通过构建钠-氢交换蛋白1（NHE-1）小干扰RNA (siRNA)抑制肾小管上皮细胞NHE-1的表达，探讨其对细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制。 方法 根据人NHE-1全长基因序列设计并合成NHE-1-siRNA，转染人肾小管上皮细胞系（HKC），以无关siRNA转染组作为对照。利用10 μmol/L 抗霉素A诱导细胞来模拟缺血缺氧环境。用RT-PCR、Western印迹法检测NHE-1的表达。用BCECF/AM、Fluo-3/AM和SBFI-AM标记HKC，通过激光共聚焦显微镜分别检测其细胞内pHi、Ca2+和Na+浓度的变化。用Hoechst 33342染色技术及Annexin V/PI 染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况。利用荧光探针JC-1检测细胞线粒体膜电位的变化。 结果 特异性NHE-1-siRNA能有效抑制HKC的NHE-1表达，与无关siRNA转染组相比，NHE-1-siRNA转染组NHE-1 mRNA和蛋白表达水平明显下调(均P < 0.05)。抗霉素A刺激后，2组细胞NHE-1 mRNA及蛋白表达水平显著上调，而NHE-1-siRNA转染组低于无关siRNA转染组；同时NHE-1-siRNA转染组细胞凋亡率（8.9%±2.9%）明显低于抗霉素A处理组（18.8%±3.2%）和抗霉素A+无关siRNA转染组（17.4%±3.6%）（均P < 0.05）；NHE-1-siRNA转染组线粒体膜电位明显增高；与无关siRNA转染组相比较，NHE-1-siRNA转染组经抗霉素A处理后，细胞内钠离子、氢离子及钙离子增高的幅度较低（P < 0.05）。 结论 NHE-1-siRNA可抑制肾小管上皮细胞内NHE-1的表达，对抗霉素A诱导肾小管上皮细胞的缺血再灌性损伤有一定的保护作用。其机制可能通过抑制NHE-1表达，延缓细胞内Na+的积聚，减轻细胞内钙离子的超载，抑制损伤细胞的线粒体膜电位下降，减少细胞的凋亡。     

间隙连接蛋白43表达改变对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 研究肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）过程中间隙连接蛋白43（connexin 43）表达和细胞间通讯功能的变化,以及上调connexin 43水平对TEMT的影响。方法 用转化生长因子（TGF）β1刺激人肾小管上皮细胞系（HKC）,检测connexin 43、上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和肌成纤维细胞标志物α-SMA、vimentin的表达。用激光共聚焦显微镜荧光漂白恢复（FRAP）技术检测HKC细胞间通讯功能。通过pLNCX2- connexin 43病毒质粒转染HKC上调connexin 43的表达,检测以上各指标的变化,观察对TEMT的影响。结果 HKC经TGF-β1刺激后．其α-SMA和vimentin mRNA和蛋白质表达增强,而E-cadherin和connexin 43表达下降（P＜0．05）,细胞间通讯功能降低（P＜0．05）。connexin 43高表达后,TEMT程度明显减轻。结论 上调肾小管上皮细胞间通讯功能可部分减轻TEMT程度。     

高尿酸通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍

目的高尿酸血症是心血管和肾脏疾病的独立风险因素,本研究拟从miR-155入手初步探索其在高尿酸导致内皮功能障
碍过程的作用机制。方法培养人脐静脉内皮细胞系HUVEC,以600 μmol/L的尿酸孵育24、48 h之后收集细胞及细胞上清液,
检测eNOS的蛋白表达及上清液的NO含量;预测并利用双荧光素酶系统验证miR-155的靶基因,随后利用荧光定量PCR检测
高尿酸环境中内皮细胞miR-155的表达情况,通过miR-155 inhibitor的转染检测它对内皮功能障碍的影响。结果600 μmol/L
的尿酸能诱导内皮细胞eNOS表达下降,NO分泌减少;microRNA在线分析软件及双荧光素酶报告实验提示eNOS的翻译水平
受miR-155直接调控;同时发现高尿酸刺激内皮细胞后miR-155的表达上调,而miR-155 inhibitor能抑制它的表达;内皮细胞转
染miR-155 inhibitor之后再进行高尿酸的孵育,eNOS的表达及NO的分泌水平与单独高尿酸孵育组相比均显著升高。结论高
尿酸可通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍。
     

葡参延年康片体内抗氧化作用的实验研究

目的:探讨葡参延年康片抗氧化、清除体内自由基的生物效应。方法:将10月龄昆明种小鼠随机分为对照组和葡参延年康片低、中、高剂量组,每组12只。连续灌胃给药40 d,采血,测定丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和超氧化物歧化酶(SOD)的活力;测定心肌脂褐质和肝脏乳酸过氧化物酶(LPO)含量。结果:葡参延年康片可减少MDA、心肌脂褐质和肝脏LPO含量(P<0.05),增强GSH-Px和SOD活性(P<0.05)。结论:葡参延年康片可有效清除体内的氧自由基,具有减少氧化应激引起的器官损伤和延缓机体衰老的潜能。     

老年大鼠肾脏微分离肾小球、肾小管及动脉血管紧张素Ⅱ受体的表达

目的: 观察老年大鼠肾脏不同部位不同亚型的血管紧张素Ⅱ受体(ATR)基因表达的改变。方法: 取3月龄及24月龄雄性Wistar大鼠肾脏,行Western印迹杂交及Northern 印迹杂交检测肾皮质AT₁R的蛋白及基因表达,行冰冻切片(厚5 μm),通过激光切割、弹射微分离系统分离肾小球、肾小管及动脉,提取RNA,利用RT-PCR方法观察AT_1aR mRNA、AT_1bR mRNA及AT₂R mRNA的表达。结果: 24月龄大鼠肾脏的AT₁R在蛋白水平及基因水平均低于3月龄大鼠。应用自动激光微分离技术成功分离了大鼠肾脏的肾小球、肾小管及小动脉。24月龄大鼠肾小球AT_1aR mRNA的表达与3月龄大鼠比较无明显差异,在肾小管表达低于3月龄大鼠,动脉表达高于3月龄大鼠;AT_1bR mRNA在肾小球、肾小管表达均低于3月龄大鼠,在动脉的表达高于3月龄大鼠;AT₂R mRNA的表达在肾小管明显高于3月龄大鼠,在肾小球及动脉的表达无明显差异。结论: 老年大鼠的肾小球、肾小管及肾内动脉各型血管紧张素受体的改变不同,有可能在肾脏增龄性改变中起重要作用。     

叔丁基羟基茴香醚对衰老大鼠肾脏缺血/再灌注损伤的保护作用

目的观察老年大鼠肾脏缺血／再灌注（I／R）模型中肾小管上皮细胞的损伤变化，探讨ROS清除剂对I／R损伤的保护作用。方法27月龄大鼠分别随机分为假手术组、I／R模型组、活性氧清除剂——叔丁基羟基茴香醚（BHA）干预组。夹闭双侧肾动脉30min再灌注18h制成I／R模型。观察肾功能、肾脏病理改变、肾小管上皮细胞凋亡情况，检测肾组织caspase-3，测定肾组织脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果（1）肾脏I／R损伤时，老年大鼠肾功能明显减退，肾组织病理改变比较明显，大量肾小管上皮细胞凋亡，肾组织caspase-3、肾组织中MDA含量增加、SOD活性下降（P〈0．05）。（2）BHA能明显的改善肾功能、组织病理改变和凋亡相关指标（P〈0、05）；BHA能减少组织中MDA含量，部分恢复组织中SOD含量。结论老年大鼠肾脏I／R损伤时肾小管上皮细胞凋亡增加，肾功能减退。ROS堆积后，线粒体损伤导致肾小管上皮细胞凋亡。清除ROS可以抑制肾小管上皮细胞凋亡，减轻I／R损伤。     

低分子肝素和尿激酶对老年大鼠肾小球内皮细胞损伤保护作用的比较

目的探讨炎症状态下增龄对肾小球内皮损伤的影响，比较低分子肝素和尿激酶对损伤的保护作用。方法3月龄及27月龄雌性Wistar大鼠各40只，随机分为正常对照组（NC组）、脂多糖（LPS）组（L组）、LPS＋氨甲环酸组（LT组）、LPS＋氨甲环酸＋低分子量肝素组（LTH组）及LPS＋氨甲环酸＋尿激酶组（LTUU组）。采用直接免疫荧光检测肾小球纤维蛋白沉积，Western印迹法检测血管内皮血栓调节蛋白（TM），纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）蛋白质表达。结果（1）LPS刺激后纤维蛋白沉积增多（P〈0．05），TM几乎无表达（P〈0．01），PAI-1表达明显上调（P〈0．05）；（2）加用氨甲环酸后，PAI-1表达进一步上调（P〈0．05）；（3）应用低分子肝素和尿激酶后纤维蛋白沉积明显减轻（P〈0．05），PAI-1表达与LT组比较明显下调（P〈0．05），TM表达增多（P〈0．05），两组之间无统计学差异。（4）老年大鼠各组肾小球纤维蛋白沉积均比相同干预组的青年大鼠明显，PAI-1的表达均较青年大鼠相同干预组显著增多，TM表达则显著减少，差别均有统计学意义（P〈0．05）。结论增龄可加重LPS诱导的肾小球内皮损伤；低分子肝素与尿激酶均能有效保护老年大鼠肾小球血管内皮损伤，两者无明显差别，但增龄可减弱低分子肝素和尿激酶对血管内皮的保护作用。     

肾小管上皮细胞转分化中整合素连接激酶表达及其与衰老的相关研究

目的探讨整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)在肾小管上皮细胞转分化过程中的作用及其对衰老进程中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)积聚增加的影响。方法分离培养3、24月龄 Wistar 雄性大鼠的原代肾小管上皮细胞,分别给予0、5、10、20～40μg/L 不同浓度的转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)刺激24h 后,用免疫细胞化学或免疫荧光方法检测细胞α-SMA、ILK、F-actin 表达;Western-blot 法检测两组细胞中纤维连接蛋白和 ILK 的表达水平;体外转录获得大鼠 ILK-c RNA 探针,检测两组细胞经刺激后 ILK mRNA 的变化。结果在0浓度 TGF-β刺激下,肾小管上皮细胞中 ILK 和 F-actin 表达水平24月龄组均比3月龄组高,但两组细胞α-SMA 表达水平均很低,且没有差别;随 TGF-β刺激浓度的增加,ILK、F-actin 和α-SMA 表达水平显著上调,其中 F-actin 与 ILK 表达增多相一致;FN 和 ILK 蛋白表达水平24月龄组分别为0.438±0.024和0.826±0.051,明显高于3月龄组的0.246±0.018和0.673±0.035(P<0.05)。结论随着肾小管上皮细胞转分化程度不断增高,ILK 表达增多,并可能通过调节 F-actin 的重排介导了转分化的过程;随增龄肾小管上皮细胞中 ILK 和 FN 表达增多,且 F-actin 表达随之增多,提示衰老肾脏的肾小管上皮细胞在应激状态下更易于发生转分化。     

STAT3抑制剂S3I－201对实验性肾小管间质纤维化的保护作用

目的探讨STAT3抑制剂S3I－201对小鼠实验性肾小管间质纤维化的保护作用。 方法采用单侧输尿管梗阻手术的方法建立肾小管间质纤维化模型。将实验小鼠随机分为药物假手术组(Sham＋S3I－201),安慰剂假手术组(Sham＋Vehicle),药物造模组(UUO＋S3I－201),安慰剂造模组(UUO＋Vehicle)4组,通过腹腔注射S3I－201溶液(药物)或0.05%DMSO PBS(安慰剂)给药,每天给药一次。造模第7天时留取肾脏标本,用Masson染色和颜色面积测算法评估胶原蛋白沉积的情况。用qRT－PCR法检测肾组织内趋化因子配体16(CXCL16),白介素－1β(IL－1β),细胞间黏附分子1(ICAM－1),转化生长因子－β(TGF－β),肿瘤坏死因子(TNF－α)的mRNA表达,用免疫组化法染色和免疫印迹法检测PDGFRβ蛋白在梗阻肾脏内的表达。 结果UUO＋Vehicle小鼠的肾间质胶原蛋白沉积显著高于Sham＋Vehicle组(P<0.05)。UUO＋Vehicle小鼠肾组织CXCL16,IL－1β,ICAM－1,TGF－β,TNF－α的mRNA表达显著高于Sham＋Vehicle组(P<0.05),UUO＋Vehicle小鼠肾组织血小板来源生长因子受体β(PDGFRβ)蛋白表达显著高于Sham＋Vehicle组(P<0.05)。经过S3I－201治疗7 d后,UUO＋S3I－201小鼠的上述各项指标均显著低于UUO＋Vehicle(P<0.05)。 结论S3I－201通过抑制多种细胞因子的mRNA表达,以及降低PDGFRβ蛋白的表达,减轻实验性肾小管间质纤维化小鼠的肾间质炎症反应,从而发挥肾脏保护作用。     

氨甲酰化促红细胞生成素对慢性肾衰竭合并急性肾损伤大鼠肾脏的保护作用

目的观察氨甲酰化促红细胞生成素(carbamylated erythropoietin, CEPO)对慢性肾脏病(CKD)合并急性肾损伤(AKI)大鼠模型的肾脏保护作用。 方法取健康雄性SD大鼠(450±20 g)39只,随机分为3组,首先制作5/6肾切除大鼠慢性肾衰模型,10 d后确认大鼠慢性肾衰竭模型造模成功。在该慢性肾衰竭模型大鼠双后肢肌肉按照8 ml/kg的剂量注射50%甘油制作合并急性肾损伤模型。第11,12,13天向各组注射：生理盐水(NS)组：腹腔注射生理盐水;促红细胞生成素(EPO)组：按照5 000 U/kg的剂量向大鼠腹腔内注射EPO;CEPO组：按照5 000 U/kg的剂量进行腹腔注射CEPO。在第1,5,10,11,13,17天对大鼠的体重、血压进行检测,同时尾静脉采血对红细胞比容、血肌酐、尿素氮进行检测,留取肾组织进行病理学PAS检测。用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05被认为差异有统计学意义。 结果与生理盐水注射组比较,CEPO组和EPO组可缓解大鼠体重的减轻幅度(F＝8.19,F＝6.84, P<0.05),可保护大鼠肾功能,降低大鼠血肌酐(F＝5.12, F＝13.72, P<0.05)和血尿素(F＝4.63,F＝12.78, P<0.05)的水平,减轻肾脏小管病理损伤(F＝9.14, F＝12.73, P<0.05),并且CEPO组能显示出更明显的作用(P<0.05),CEPO相对于EPO能够缓解升高红细胞比容的副作用(F＝8.27, P＝0.019)。 结论CEPO对CKD合并AKI模型大鼠能起到明显的肾脏保护作用,并且相对于EPO治疗能降低引起红细胞比容升高的副作用。