中国北京市区健康人群白细胞介素6基因启动子区基因的多态性及与亚裔和高加索人群的比较

目的：动脉硬化、老年痴呆、糖尿病、骨质疏松等均有循环中炎症介质持续升高的表现。观察北京市区健康人循环中炎症介质白细胞介素6启动子区基因多态性与循环中白细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原的关系，并评价白细胞介素6基因多态性的种族差异。方法：采用随机整群抽样的方法于2003—03／2004—03筛选中国北京地区30岁以上自我评价健康的汉族居民662人，男365人，女297人。通过身体检查及血液学及血生化学检测，了解调查对象健康状况；测定入选人群白细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原；检测白细胞介素6启动子区174(G／C)，597(G／A)。572(G／C)基因多态性，观察其与循环中炎症指标白细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原的关系。结果：按意向处理分析，进人结果分析662人。①人选健康成人662人．174位均为GG型，未发现GC和CC型；597位GG型占99．24％，仅有5人为GA型，未发现CC型；572位存在GG。CC，GC3种基因型。G和C等位基因频率分别为0．22和0．78，基因型和等位基因频率均无性别差异。②G等位基因(GG+GC型)携带者循环中自细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原水平明显高于cc基因型[(2．91&;#177;2．21)ng／L,(2．43&;#177;2．31)mg／L，(3．05&;#177;0．71)g／L；(2．44&;#177;1．47)ng／L．(1．41&;#177;1．57)mg／L，(2．70&;#177;0．64)g／L,P=0．03，0．01，0．01]。③中国北京地区汉族人群白细胞介素6启动子区174(G／C)，597(G／A)、572(G／C)的基因型分布与日本、韩国亚裔人群相似(174位和597位几乎均为GG型．572位G等位基因频率分别为0．28，0．23，0．25，P&;gt;0．05)。而明显不同于德国、瑞典高加索人群(174位存在GG。GC，CC，597位存在GG，GA．AA3种基因型。572位G等位基因频率分别为0．95，0．93，P&;lt;0．01)。结论：白细胞介素6启动子区174(G／C)，597(G／A)，572(G／C)基因多态性存在种族差异，亚裔人群不存在174(G／C)，597(G／A)基因多态性，572位基因型频率也明显不同于高加索人群。572(G／C)位存在基因多态性并影响循环中白细胞介素6的表达从而影响机体炎症状态。G等位基因为少见基因，其携带者白细胞介素6和超敏C反应蛋白水平明显高于CC型个体。     

高尿酸通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍

目的高尿酸血症是心血管和肾脏疾病的独立风险因素,本研究拟从miR-155入手初步探索其在高尿酸导致内皮功能障碍过程的作用机制。方法培养人脐静脉内皮细胞系HUVEC,以600μmol/L的尿酸孵育24、48 h之后收集细胞及细胞上清液,检测eNOS的蛋白表达及上清液的NO含量;预测并利用双荧光素酶系统验证miR-155的靶基因,随后利用荧光定量PCR检测高尿酸环境中内皮细胞miR-155的表达情况,通过miR-155 inhibitor的转染检测它对内皮功能障碍的影响。结果 600μmol/L的尿酸能诱导内皮细胞eNOS表达下降,NO分泌减少;microRNA在线分析软件及双荧光素酶报告实验提示eNOS的翻译水平受miR-155直接调控;同时发现高尿酸刺激内皮细胞后miR-155的表达上调,而miR-155 inhibitor能抑制它的表达;内皮细胞转染miR-155 inhibitor之后再进行高尿酸的孵育,eNOS的表达及NO的分泌水平与单独高尿酸孵育组相比均显著升高。结论高尿酸可通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍。     

高糖对人肾小管上皮细胞氧化应激及蛋白质损伤效应的实验研究

目的 探讨高糖对人肾小管上皮细胞(HKC)氧化应激及蛋白质氧化损伤的作用.方法 将体外培养的HKC分为3组:对照组、高糖短期处理组、高糖长期处理组.对照组葡萄糖浓度为5.5mmol/L,高糖处理组葡萄糖浓度为30mmol/L.高糖短期处理组分为6个时间点,即30min及1、6、12、24、48h高糖刺激组;高糖长期处理组为高糖连续刺激2个月.用活性氧(ROS)捕获剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯(CM-H2DCFDA)孵育各组细胞,通过流式细胞技术和激光共聚焦显微镜检测高糖处理后不同时间点HKC中ROS的荧光强度以反映细胞内ROS的水平,用共聚焦显微镜检测荧光探针JC-1的荧光强度来表示线粒体膜电位,用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法测定细胞内蛋白质羰基含量的变化.结果 流式细胞技术和激光共聚焦显微镜检测显示,经高糖刺激后,HKC内ROS含量在1h时达高峰,随后逐渐降低;线粒体膜电位在高糖刺激后短时间内(1h)有增高,其后下降DNPH比色法显示,短时高糖刺激对细胞中蛋白质羰基含量影响不明显(P>0.05),高糖刺激2个月时蛋白质羰基含量与短时刺激相比明显升高(P<0.05).结论 高糖处理可使HKC细胞氧化应激增强,从而造成生物大分子蛋白质的损伤.     

大网膜包裹明胶-间充质干细胞复合物对马兜铃酸肾病保护作用的研究

目的研究大网膜包裹明胶-间充质干细胞(MSCs)复合物对马兜铃酸肾病(AAN)小鼠肾脏的修复和保护作用。 方法使用明胶与间充质干细胞共培养构建间充质干细胞-明胶复合物。用CCK-8法评价MSCs与明胶的生物相容性以及MSCs的增殖能力。将体重为20~25 g的健康雄性C57BL/6小鼠24只随机分为4组：正常对照组(Control组)、马兜铃酸肾病模型组(AAN组，腹腔注射马兜铃酸溶液)、大网膜包裹MSCs治疗组(MSCs组)、大网膜包裹MSCs-明胶复合物治疗组(MSCs-Gel组)。利用小动物活体成像系统观察MSCs在小鼠体内的分布和存活情况；检测各组小鼠的血肌酐、尿素氮水平变化，观察肾脏组织学变化及相关纤维化指标如α-SMA、TGF-β和胶原变化情况。 结果明胶对MSCs的增殖能力无明显影响。与单纯MSCs组相比，MSC-Gel组的MSCs在小鼠肾脏内存活时间更长，且血肌酐、尿素氮明显降低，肾组织病理改变纤维化程度明显减轻，α-SMA、TGF-β、Col-Ⅰ表达亦显著降低(均P<0.05)。 结论大网膜包裹明胶-MSCs复合物对AAN小鼠肾脏具有良好的修复和保护作用。     

肾脏病的临床循证教学分析

目的 探讨循证医学在肾脏病临床教学中的应用.方法 分析总结肾脏病循证医学教学的可行性及运作方法.结果 肾脏病循证医学教学可对医学生及进修医师进行全方位的训练和指导,使患者受益.结论 结合各学科特点将循证医学思想融入临床实践与教学中,将有助于我国整体临床实践及教学的合理和健康发展.     

尿酸通过诱导线粒体钙稳态失衡介导内皮细胞炎症反应

目的探讨线粒体钙稳态失衡在高尿酸（UA）导致的血管内皮细胞炎症中的病理生理机制。方法采用Fluo-3 AM及Rhod-2 AM分别对UA刺激后的人脐静脉内皮细胞（HUVEC-C）进行胞质钙离子浓度（[Ca2＋]i）和线粒体钙离子浓度（[Ca2＋]mito）的特异性染色;RT-PCR法检测其C反应蛋白（CRP）和细胞间黏附分子1（ICAM-1）的mRNA表达变化;Western blot检测ICAM-1的蛋白变化;ELISA法检测其培养液上清白细胞介素6（IL-6）的释放变化情况。结果HUVEC-C经600μmol/L的UA刺激后,其[Ca2＋]i未见明显变化,而[Ca2＋]mito呈波浪式升高（P〈0.05）,并在24 h内保持较高的状态;CRP、ICAM-1、IL-6均在UA刺激后升高（P〈0.05）。结论UA可导致内皮细胞炎症反应,[Ca2＋]mito的升高与之相关,提示线粒体钙稳态失衡在UA导致的内皮炎症反应中起一定的介导作用。     

携带SV40T/HSV-tk基因永生化正常成人肝细胞的构建

目的构建永生化正常成人肝细胞为生物型人工肝提供安全有效的人肝细胞源。方法转染包装细胞,获得逆转录病毒;将该病毒感染正常成人肝细胞HL-7702;更昔洛韦毒性实验检测转染后肝细胞内HSV-tk基因;RT-PCR法检测转染后细胞内SV40T的mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色检测转染后细胞内SV40T基因的蛋白表达。结果更昔洛韦检测转染后的肝细胞存活良好,而转染前的肝细胞死亡。RT-PCR法显示转染后的肝细胞内存在SV40T mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色法显示转染后肝细胞内存在SV40T蛋白。结论转染后的正常成人肝细胞中含有SV40T和HSV-tk基因,并表达相关蛋白。     

低亲和力钠依赖二羧基转运蛋白随增龄表达变化的研究

目的 研究大鼠及人类肾脏低亲和力钠依赖(Na~+/)二羧基转运蛋白(NaDC1)随增龄的表达变化规律并探讨其在肾脏衰老变化中的意义。方法 采用Northern杂交、Western印迹及免疫组化等方法对大鼠出生后1d、7d、1个月、3个月、12个月、24个月及少年、中青年、老年正常人肾脏 NaDC1的表达变化。结果 大鼠NaDC1 mRNA表达呈现随肾组织发育成熟表达逐渐增强,1个月达高峰,后随增龄表达下降的趋势(P<0.05)。Western印迹显示NaDC1蛋白随鼠龄增高表达逐渐增强,3个月达高峰,后表达渐降的趋势。免疫组化结果显示大鼠及人类肾组织NaDC1分别表达于近端小管刷状缘,大鼠生后1d表达最弱,后表达渐强,到3个月达高峰(5.30±1.52比1.40±0.43,P<0.01),后呈现渐降的趋势(P<0.05)。人类肾组织NaDC1表达呈现随增龄渐降的趋势。结论 大鼠及人肾组织进入衰老时,NaDC1 mRNA及蛋白表达均呈现下降的趋势,可作为对肾脏衰老观察的指标之一。     

抑制细胞间通讯功能可加速人成纤维细胞的衰老

目的研究间隙连接蛋白connexin43在人成纤维细胞衰老过程中的调节作用。方法设计并合成针对人connexin43的双链RNA(siRNA),抑制人二倍体成纤维细胞WI-38细胞的connexin43表达和细胞间通讯功能,观察对其衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率、细胞增殖能力、细胞周期调节蛋白P27、P21表达水平等衰老表型的影响。结果我们合成的siRNA-cx43可高效、特异的抑制connexin43 mRNA和蛋白质表达及细胞间通讯功能。转染WI-38细胞后,细胞增殖能力降低、细胞SA-β-gal染色阳性率(75.32±5.17)较对照组(32.48±3.94)和转染siRNA-con组(37.81±4.1 2)细胞升高(P<0.05),P27、P21表达增加,转染siRNA-cx43的WI-38细胞增殖能力显著降低,细胞变扁平、肥大,细胞SA-β-gal染色阳性率达100%,细胞提前出现衰老。结论间隙连接蛋白connexin43对WI-38细胞的衰老进程有重要的调节作用,其表达减少和细胞间通讯功能降低,可以促进WI-38细胞衰老进程。