Mxi1基因敲除小鼠遗传背景的转换研究

目的 对FVB/N品系Mxi1基因敲除(knock out,KO)(Mxi1-/-)小鼠进行遗传背景转换,为研究疾病发病机制提供更多种类的基因修饰小鼠.方法 将FVB/N品系杂合子小鼠(Mxi1+/-)与异性C57BL/6品系野生型(wild type,WT)小鼠(Mxi1+/+)杂交,获得杂合子F1代后将其与C57BL/6品系Mxi1+/+小鼠回交,再选择F2杂合子与C57BL/6品系Mxi1+/+小鼠回交,依此再回交8次后,子代互交.利用鼠尾DNA进行基因型鉴定及微卫星DNA(msDNA)检测,组织信使RNA(mRNA)和组织蛋白检测背景转换效率.结果 基因型鉴定为Mxi1-/-的互交子代小鼠msDNA检测结果与WT型C57BL/6小鼠一致,与FVB/N小鼠不同.PCR和Western印迹结果显示,随机选取的任意自交子代纯合子小鼠体内不表达Mxi1的mRNA和蛋白质,成功获得C57BL/6品系Mxi1-/-小鼠.结论 通过杂交-回交的方式成功获得的新品系Mxi1-/-小鼠能稳定地将突变基因传递给子代.这一成果为疾病动物模型的建立提供了更多的选择.     

单核细胞趋化蛋白-1通过促进胰淀素表达调控胰岛β细胞凋亡

目的观察单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)对胰岛β细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法体外培养大鼠胰岛β细胞株INS-1E,给予1ng/ml的MCP-1刺激48h后,real-time PCR及western blot检测细胞中Amylin的mRNA及蛋白表达水平,同时流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞转染Amylin SiRNA,再给予MCP-1刺激,同样采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况。结果 INS-1E细胞经MCP-1刺激后,细胞中Amylin的mRNA及蛋白表达水平均升高(P<0.05),细胞出现了凋亡现象。而预先转染了抑制Amylin表达的siRNA后再进行MCP-1的刺激,此时细胞的凋亡率低于单独刺激组(P<0.05)。结论 MCP-1通过促进胰淀素的表达调控胰岛β细胞的凋亡,从而影响血糖代谢。     

增龄对急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1和MCP-1表达的影响

目的研究增龄对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺组织MCP-1和ICAM-1表达的影响,探讨老年大鼠对炎性刺激易感的可能机制。方法青年及老年大鼠均随机分为对照组和LPS组。应用免疫组化技术检测大鼠肺组织ED-1阳性细胞浸润情况,应用Western blot和Northern blot分别检测肺组织MCP-1和ICAM-1蛋白质和基因表达。结果(1)青年和老年对照组大鼠肺组织内几乎无ED-1阳性细胞,注射LPS后,青年和老年LPS组ED-1阳性细胞浸润均明显增强,并且老年鼠明显多于青年鼠(P<0.05)。(2)青年和老年对照组大鼠肺组织内均有基础量的MCP-1和ICAM-1表达,老年与青年组之间有显著性差异,注射LPS后青年和老年大鼠MCP-1和ICAM-1表达均较对照组显著上调,老年大鼠上调更加明显,具有显著性差异(P<0.05)。以相同鼠龄MCP-1和ICAM-1表达的增加量为变量,进行t检验,发现老年MCP-1和ICAM-1表达的增加量仍显著高于青年大鼠(P<0.05)。结论增龄可上调肺组织MCP-1、ICAM-1表达,并加强脂多糖诱导MCP-1、ICAM-1表达的作用,加重肺部炎症反应。     

利用ChIP-seq/SILAC技术筛选KLF15的靶向基因SUMO1

目的利用ChIP-seq和SILAC-LC/MS技术寻找Krupple样因子(KLF15)的靶向基因及其结合位点。 方法①利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)特异性富集并纯化人原代肾系膜细胞(HRMC)中可与KLF15结合的DNA片段,通过高通量测序技术(HiSeq)检测和分析,得到直接与KLF15结合的基因;②利用稳定同位素标记细胞培养技术(SILAC),重链和轻链同位素标记的培养HRMC,分别对重链实验组(HK)转染KLF15质粒,轻链对照组(LC)转染空载体对照,收集蛋白进行液质谱(LC/MS)检测,得到过表达KLF15后的差异蛋白;③对ChIP-seq及SILAC结果进行GO和Pathway分析,同时将二者进行交集筛选出KLF15的靶向基因,而后利用http：//meme.edi.edu.au/网站获得靶基因的Modifs并对候选基因小泛素样修饰因子1(SUMO1)进行ChIP-PCR及双荧光素酶验证。以SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。 结果ChIP-seq获取了2 478个KLF15直接调控的可能靶向基因,SILAC-LC/MS检测到KLF15过表达后有1 357个差异蛋白,综合ChIP和SILAC结果,我们分析得到52个共同差异表达的基因和(或)蛋白及其3个modifs,其中5个蛋白参与细胞增殖相关进程;结合GO和Pathway分析结果,最终筛选出SUMO1作为KLF15调控系膜细胞增殖的靶向基因。Motif分析发现SUMO1启动子区存在KLF15的结合序列;利用ChIP-PCR和双荧光素酶报告基因验证KLF15转录因子可以直接结合SUMO1的启动子区并发挥作用。 结论KLF15通过结合SUMO1的启动子区,调节SUMO1的表达。     

体外瞬时转染TIMP-1基因促进成纤维细胞增殖

目的：探讨体外瞬时转染组织型金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）质粒对小鼠成纤维细胞细胞周期和增殖的影响。方法：构建表达小鼠TIMP-1的质粒，体外转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,以转染空质粒的NIH3T3细胞作对照，采用RT—PCR和westem印迹分析检测TIMP—1在基因和蛋白质水平的表达；采用BrdU法和MTT法检测细胞增殖能力和活力；流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：转染TIMP-1质粒的NIH3T3细胞在24h即有明显的TIMP-1mRNA表达和蛋白质表达上调；与转染空质粒的NIH3T3细胞相比，转染TIMP-1质粒的NI心L细胞48h的BrdU摄取率显著升高（P〈0．01），72h的m摄取率显著升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示与转染空质粒的细胞相比，72h时TIMP-1质粒转染组G0／G1期细胞显著减少（P〈0．01），s期细胞比例显著升高（P〈0．01）。结论：体外瞬时转染TIMP-1质粒可以有效地使TIMP-1的基因和蛋白质水平在NIH3T3细胞高表达，TIMP-1高表达显著提高细胞BrdU和MTT摄取率，减少G0／（31期细胞比例，提高s期细胞比例，提示TIMP—1高表达能够促进戍纤维细胞增殖，从而加速间质纤维化的进程。     

GF-β1对诱导肾间质成纤维细胞活化并表达MMP-9及TIMP-1的影响

目的 研究转化生长因子-β 1 （transforming growth factor beta-1 ,TGF-β 1 ） 诱导的肾间质成纤维细胞（NRK-49F） 发生表型转化时基质金属降解酶MMP-9 及其抑制因子TIMP-1 表达的变化及对分泌纤维连接蛋白（fibronectin,FN） 的影响。 方法 以不同浓度hTGF-β 1 （0 ng/ml 、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml） 刺激NRK-49F 细胞48 h,分别应用ELISA法检测细胞上清FN 的浓度,免疫荧光检测细胞表型标记物α-SMA、Vimentin 的表达,Western blot、Northern blotting 方法检测MMP-9、TIMP-1 的基因及蛋白质表达。 结果 0.5 ～ 10 ng/ml TGF- β 1 随刺激浓度增高NRK-49F 细胞表达α-SMA明显增多、Vimentin 明显减少,细胞上清中FN 的含量显著增加（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01） ;同时,TGF-β 1 浓度＞ 2 ng/ml 时显著上调TIMP-1 mRNA 及蛋白表达水平（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01） ;以上效应均呈浓度依赖性,但对细胞MMP-9 mRNA 及蛋白表达无明显影响（P ＞ 0.05）。 结论 TGF- β 1 能诱导肾间质成纤维细胞活化,使FN 的分泌增多,该作用可能与TGF-β 1 上调了TIMP-1 基因及蛋白质水平,进而减少细胞外基质（extracellular matrix,ECM） 的降解有关。     

两种方法对肾小球RNA测序数据均一化效果的研究

目的 利用不同方法对人肾小球RNA测序数据均一化效果进行了研究,寻找一种能更好地均一化处理数据的方法.方法 选取肾癌手术患者的癌旁组织,利用筛网技术提取肾小球.采用Trizol方法提取肾小球RNA,利用Ion Xpress平台进行测序.利用DESEQ2软件中的rlog和median/ratio方法对测序数据结果进行均一...     

人TIMP-1转基因小鼠肾组织内外源基因功能表型的鉴定

目的 对人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）转基因小鼠肾组织内外源人TIMP-1基因的功能表型进行鉴定,为深入研究TIMP-1在肾脏疾病进展过程中的病理生理作用奠定基础。方法 3月龄野生型小鼠（n=8,正常组）和hTIMP-1转基因小鼠（n=8）肾组织石蜡切片行PAS染色,观察肾脏组织结构变化。采用Northern杂交、Western印迹方法检测两组小鼠肾组织内h／mTIMP-1、mTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、MMP-9、MMP-2和COLⅣa5mRNA及蛋白质表达;明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的活性。反向酶谱法检测TIMP-1的活性。结果 hTIMP-1转基因小鼠与正常组小鼠相比,肾组织结构未见显著变化。与正常组小鼠相比,hTIMP-1转基因小鼠肾组织内h／mTIMP-1mRNA、蛋白表达及活性显著升高（P＜0．05）;TIMP-2、MMP-2mRNA和蛋白表达降低（P＜0．05）;MMP-9的活性增高（P〈0．05）,而MMP-2的活性则降低（P＜0．05）。两组小鼠mTIMP-1、TIMP-3、MMP-9和COLIVa5的mRNA表达没有显著性差异（P＞0．05）。结论 外源基因在人TIMP-1转基因小鼠肾组织内稳定表达并导致MMPs／TIMPs系统发生代偿性变化。     

利妥昔单抗或他克莫司联合糖皮质激素治疗特发性膜性肾病的疗效比较

目的比较利妥昔单抗或他克莫司联合糖皮质激素治疗特发性膜性肾病的疗效及安全性。方法选取中间人民解放军总医院肾内科2014年3月至2018年3月分别使用利妥昔单抗联合小剂量激素(利妥昔单抗组)和他克莫司联合小剂量激素(他克莫司组)治疗的特发性膜性肾病患者。观察2组患者在治疗前、治疗1个月、3个月、6个月、12个月的24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、肌酐水平的变化,评估治疗总体有效率,观察不良反应发生情况。结果共纳入研究对象149例,其中利妥昔单抗组62例,他克莫司组87例,2组患者治疗前在年龄、性别、24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐等方面均无显著性差异(P0.05)。治疗12个月后,利妥昔单抗组的总有效率(70.97%)与他克莫司组(64.37%)相比,差异无统计学意义(P0.05),但利妥昔单抗组复发率远低于他克莫司组(P0.01)。2组患者治疗后24 h尿蛋白水平较治疗前均有效降低(P0.01),血清白蛋白水平较治疗前均有所提升(P0.01),且2组对24 h尿蛋白和血清白蛋白水平的改善效果相近,差异无统计学意义(P0.05);而在血肌酐变化方面,利妥昔单抗组患者治疗后较治疗前无显著差异(P0.05),总体肾功能稳定,他克莫司组患者治疗后血肌酐较治疗前有所上升(P0.01),提示出现肾功能损害。在不良反应方面,利妥昔单抗组主要表现为感染、输注反应,他克莫司组则表现为感染、肝肾功能损害、血糖升高、胃肠道反应、脱发等,利妥昔单抗组的不良反应类型和出现不良反应的人数更少。结论利妥昔单抗与他克莫司均能有效缓解特发性膜性肾病,降低蛋白尿,但与他克莫司比较,利妥昔单抗具有不良反应低、复发率低、更经济便利的优点,有望成为一线治疗药物。     

下一代测序联合质谱检测诊断普城沙雷菌感染

目的普城沙雷菌是一种革兰阴性肠杆菌,广泛存在于自然界,主要生长在植物、动物和昆虫中,其感染人体非常少见,并表现出多种抗生素耐药的特点。目前临床工作中尚无普城沙雷菌特异性的检测方法而对该病难以诊断。本文通过下一代测序联合质谱检测诊断普城沙雷感染一例,探讨该方法应用于临床诊断的价值。方法通过下一代测序联合质谱检测,诊断一例包括血培养在内的多项检查均为阴性,临床表现为发热、肌痛、肌肉肿胀的IgA肾病患者为普城沙雷菌感染。结果质谱检测结果发现,患者体温升高时大量与炎症、免疫及包括普城沙雷菌在内的多种细菌相关的蛋白质升高,多种与DNA复制、生长因子及细胞凋亡相关的信号通路被激活。下一代测序结果表明,患者体温升高时多种细菌(包括沙雷菌属、耶尔森菌属、埃希菌属、果胶杆菌属、沙门菌属、伯克菌属、克雷白杆菌属、泛生菌属、微杆菌属等)相关的基因片段升高,其中普城沙雷菌相关的基因片段明显高于其他沙雷菌,测得序列条数为72 726条(占63.5%)。在多种抗生素治疗无效的基础上,予以复方磺胺甲嗯唑治疗后,患者的体温逐渐降至正常,肌痛、肌肉肿胀以及一般情况逐渐好转,C反应蛋白、白细胞介素6、降钙素原、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等多项指标逐步恢复正常。结论下一代测序联合质谱检测可以应用于临床中复杂疾病的诊断,尤其对感染性疾病的诊断具有一定提示意义。