人尿酸转运蛋白在肾小管上皮细胞的定位表达研究

目的 明确人尿酸转运蛋白(hUAT)在人肾小管上皮细胞(HKC)内的定位表达情况&#65377; 方法 利用DNA重组技术构建hUAT&#65377;绿色荧光蛋白的融合基因分别导入人HKC及非洲爪蟾卵细胞&#65377;构建hUAT的谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体并制备抗hUAT的多克隆抗体&#65377;利用免疫荧光&#65380;Western印迹及激光共聚焦显微镜等技术观察hUAT在人HKC的定位表达&#65377;结果 成功制备了兔抗hUAT-GST多克隆抗体&#65377;利用该抗体及构建的pEGFP-hUAT荧光表达载体进行Western印迹和免疫荧光检测,结果表明hUAT是一种膜蛋白,并且表达于人HKC胞膜上,Northern blot结果也表明人HKC在高尿酸环境中的hUAT表达水平明显上调(P < 0.05)&#65377;结论 hUAT并非典型的膜转运蛋白,可能是以二聚体的形式才能够表达在细胞膜上,它在细胞内的定位表达可能需要特殊的转录调控机制&#65377;     

高糖与高尿酸通过醛糖还原酶通路协同作用加重内皮细胞损伤

目的寻找高血糖与高尿酸血症协同加重内皮细胞损伤的共同作用靶点和分子机制,为糖尿病合并高尿酸血症患者心血管疾病的保护提供干预靶点。 方法用人脐静脉内皮细胞系(HUVEC-C)给予高糖(30 mmol/L,HG)、高尿酸(600 μmol/L,UA)和高糖(HG)＋高尿酸(UA)联合培养48 h。利用10 μmol/L阿司他丁阻断醛糖还原酶(AR)的活性。实时定量PCR检测内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和AR mRNA的表达;Western blot检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (NOX2)、NOX4、eNOS和AR蛋白的表达;共聚焦显微镜检测细胞内ROS的活性;一氧化氮(NO)试剂盒检测NO活性。 结果与单独HG组和UA组相比,HG＋UA共培养组明显降低eNOS mRNA水平和蛋白表达,减少NO产生,增加内皮细胞胞内ROS活性;HG＋UA共培养明显上调AR mRNA水平和蛋白表达。应用AR抑制剂能够明显增加HG＋UA组内皮细胞eNOS mRNA水平和蛋白表达,增加内皮细胞NO的分泌水平。AR抑制剂能够明显下调HG＋UA组内皮细胞NOX4的蛋白表达,对NOX2无影响;降低细胞内ROS的含量。 结论高血糖和高尿酸协同作用通过激活醛糖还原酶途径下调内皮细胞eNOS的表达,增加ROS活性,减少NO的产生,加重内皮细胞功能障碍;而抑制醛糖还原酶,能够通过抑制NOX4表达,阻断这种协同损伤作用。     

IgA肾病患者肾脏组织中差异细胞因子的探索研究

目的筛选IgA肾病(IgAN)患者肾脏组织中的差异蛋白质-细胞因子,进一步探讨IgAN的发病机制。 方法入选年龄18～60岁,解放军总医院肾脏病科住院肾活检确诊为IgAN患者10例;泌尿外科行肾癌肾脏切除的患者10例,取癌旁6 cm以外正常肾脏组织作为对照。肾脏组织利用L-493细胞因子抗体芯片进行检测,筛选差异蛋白质,并对差异蛋白质进行基因本体论(GO)分析。以IL-33(白介素-33)利用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行验证。采用IBM SPSS Statistics 19.0软件对结果进行统计分析,利用T检验对差异蛋白质进行筛选,P<0.05,并且差异蛋白质差异倍数>1.4认为是差异蛋白质。 结果L-493细胞因子抗体芯片检测,在20例患者中(IgAN组10例,对照组10例),发现了25种差异蛋白质,GO分析结果表明：这些蛋白质主要与应激、细胞粘附、蛋白质代谢、信号转导相关。ELISA验证结果显示：IgAN患者肾组织中IL-33表达水平显著高于对照组。 结论IgAN患者肾脏组织中差异表达蛋白质直接或间接调控着炎症、细胞增殖和凋亡及纤维化过程。IL-33可能与IgAN发病机制有关。     

miR-34a调控HEK293细胞自噬作用的初步研究

目的探讨miR-34a对HEK293细胞自噬作用的影响。方法采用miR-34a模拟物(模拟物组)和miR-34a抑制剂(抑制剂组)分别转染HEK293细胞,并设空白对照(对照组)。采用定量PCR检测miR-34a、p53基因表达的变化,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ及p53表达的变化,并采用生物信息学方法分析miR-34a对自噬相关基因(Atg6/beclin1、sestrin2、FoxO3等)的可能作用。结果定量PCR结果显示,模拟物组miR-34a表达显著上调(P<0.05),抑制剂组miR-34a表达显著下调(P<0.05)。与对照组相比,miR-34a模拟物可显著抑制HEK293细胞LC3Ⅱ蛋白的表达(P<0.05),而miR-34a抑制剂则显著上调HEK293细胞LC3Ⅱ蛋白的表达(P<0.05)。定量PCR和Western blotting结果显示,各组p53mRNA及蛋白表达无统计学差异。生物信息学分析显示,Atg6/beclin1、sestrin2、FoxO3等自噬相关基因是miR-34a潜在的靶基因。结论miR-34a能抑制HEK293的自噬作用,可能是通过直接抑制...     

低分子肝素和尿激酶对大鼠肾小球炎症保护作用的比较

目的比较低分子量肝素和尿激酶对肾小球炎症反应的保护作用。方法3月龄雌性Wistar大鼠40只,随机分为对照组(NC组)、脂多糖(LPS)组(L组)、LPS 氨甲环酸组(LT组)、LPS 氨甲环酸 低分子量肝素组(LTH组)及LPS 氨甲环酸 尿激酶组(LTU组),每组8只。采用直接免疫荧光检测肾小球纤维蛋白沉积和CD11b阳性细胞分布情况,Western blotting检测内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白质表达。结果NC组大鼠肾小球内无纤维蛋白沉积和CD11b阳性细胞;ICAM-1有少量表达。与NC组比较,L组纤维蛋白沉积(9.1%±1.6%)和CD11b阳性细胞(11.2±2.1)增多(P<0.05);ICAM-1表达(0.23±0.09)明显上调(P<0.05)。与L组比较,LT组纤维蛋白沉积(23.4%±3.2%)和CD11b阳性细胞(20.4±3.5)进一步增多;ICAM-1表达(0.44±0.16)进一步上调(P<0.05)。与LT组比较,LTH组和LTU组纤维蛋白沉积(分别为11.3%±1.4%,10.6%±1.5%)和CD11b阳性细胞(分别为7.3±1.8,8.4±1.6)明显减少(P<0.05或0.01);ICAM-1表达(分别为0.19±0.10,0.18±0.09)明显下调(P<0.05),LTH、LTU两组间无统计学差异。结论低分子肝素与尿激酶均能有效减少纤维蛋白沉积,起到减轻肾小球炎症反应的作用。     

高尿酸通过miR-663下调转化生长因子β1抑制内皮细胞迁移

目的探讨高尿酸通过miR-663影响内皮细胞迁移功能的机制。方法培养人脐静脉内皮细胞系（EA．hy926）,用600μmol／L尿酸孵育48h,实时定量PCR检测miR-663的水平,并检测高尿酸患者血清中miR-663水平;利用双荧光素酶试验预测并验证miR-663的靶基因;检测高尿酸条件下内皮细胞中转化生长因子β1（transforming growth fator beta1,TGF—β1）的表达水平,利用miR-663抑制物、TGFB1siRNA转染及划痕实验观察高尿酸如何通过miR-663及其靶基因影响内皮细胞的迁移功能。结果高尿酸培养条件下内皮细胞中miR-663表达水平明显升高,高尿酸血症患者血清中miR-663的水平也高于正常人;双荧光素酶试验结果表明TGFB1的翻译水平受miR-663直接调控;高尿酸能明显抑制细胞的迁移能力,而高尿酸条件下TGF-β1的表达水平也明显下降,转染miR-663抑制物后,TGF-β1表达水平升高,内皮细胞迁移能力也明显改善,但是利用siRNA抑制TGF—β1的表达后,miR-663抑制物不能再促进内皮细胞的迁移。结论高尿酸通过miRNA-663下调TGF—β1而抑制细胞迁移。     

大鼠低亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白对枸橼酸及草酸转运电生理特性的研究

目的 探讨大鼠低亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白(SDCT1)对枸橼酸及草酸的转运特点。方法克隆出大鼠SDCT1全长cDNA基因。应用爪蟾卵母细胞异源性表达SDCT1，并使用双电极电压钳法记录通道电流。通过改变灌流液中枸橼酸、草酸的浓度，以及两种底物转运时钠离子的浓度及pH值，对其特性进行了研究。结果SDCT1对枸橼酸及草酸的转运均为底物浓度及钠离子依赖。pH值变化显著影响2者的转运。但低pH对草酸的转运影响要远大于枸橼酸。结论在临床实践中，虽然升高尿液pH值可以抑制枸橼酸的重吸收，发挥其抑制钙盐沉积的功能。但过度地碱化尿液也会使草酸的重吸收受到抑制，使草酸大量存留在尿中而导致结行。保持适当的尿酸碱度是必要的。     

霉酚酸酯抑制大鼠肾脏缺血再灌注损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的研究霉酚酸酯(MMF)对大鼠肾脏缺血再灌注(I／R)损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制。方法Wistar大鼠随机分为假手术组、I／R组、I／R MMF组。双侧肾动脉夹闭30min再灌注18h制作动物模型。观察肾功能及肾脏病理改变。以原位末端标记(TUNEL)及DNA电泳方法检测肾小管上皮细胞凋亡情况。RT—PCR法测定肾组织肿瘤坏死因子α(TNF—α)mRNA表达。Western印迹法测定肾组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、8蛋白表达。结果肾脏缺血30min再灌注18h后，大鼠肾功能明显减退，肾脏病理改变明显，大量肾小管上皮细胞凋亡，肾组织中TNF—α mRNA表达及caspase-3、-8蛋白表达显著增加。MMF能显著改善肾功能和肾脏组织病理学改变，减轻肾小管上皮细胞凋亡，显著下调TNF—α mRNA表达及caspaae-3、-8蛋白表达。结论MMF能抑制肾脏I／R损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡．保护肾功能，其作用至少部分是通过减少肾组织局部TNF-α含量，从而影响了caspase依赖的外源性凋亡途径实现的。     

尿激酶对IgA肾病毛细血管密度的影响

目的:观察尿激酶治疗后IgA肾病毛细血管密度的变化.方法:观察不同病理程度下,IgA肾病毛细血管密度的变化,同时比较尿激酶治疗前后,10例重复肾活检IgA肾病患者的毛细血管密度变化.结果:①随着病变的加重,IgA肾病肾小球毛细血管袢密度、肾小管周围毛细血管密度均随之减小.② 10例IgA肾病应用尿激酶治疗后,重复肾活检显示,治疗前后肾小球毛细血管袢密度(/肾小球)分别为:36.5±8.7和45.4±9.9,两者相比具有统计学差异(P<0.05),肾小管周围毛细血管密度(/肾小管)明显升高(治疗前0.9±0.2 vs治疗后1.4±0.3,P<0.05).结论:尿激酶治疗可能是通过增加肾小球和肾间质毛细血管的密度而延缓IgA肾病的进展.     

不同取材方式对肾脏培养细胞样品超微结构的影响

目的研究不同取材方式对透射电镜肾脏培养细胞样品超微结构的影响。 方法以大鼠肾小球系膜细胞(RMC)和人肾小管上皮细胞株(HK-2)为实验对象，采取5种不同的取材方式，分别为：刮取-离心-固定组、刮取-固定-离心组、固定-刮取-离心组、消化-离心-固定组、消化-固定-离心组。电镜下比较不同取材方式样品细胞超微结构的形态变化。 结果透射电镜下观察，消化-固定-离心组细胞形态呈圆形或近圆形，超微结构保存良好，易于观察研究；其次为固定-刮取-离心组，细胞呈长梭形，不利于低倍镜下观察，但超微结构保存良好；再次为刮取-固定-离心组，超微结构保存一般；细胞超微结构保存最差的为消化-离心-固定组和刮取-离心-固定组。 结论消化-固定-离心可能为透射电镜肾脏贴壁培养细胞样本的最佳取材方式。