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错配PCR致突变的实验条件研究 总被引:10,自引:0,他引:10
目的:对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。方法:用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1-Red,转种传代7d,选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变,比较不同Mg^2 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率。结果:在XL1-Red菌株中转种7d(约50代)后,测定突变率<0.1%。在错配PCR中,增加Mg^2 浓度可提高突变率,增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果。在dITP配以低浓度的dATP或dGTP时突变率较低,使用5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L MnCl2、1mmol/L dTTP和dCTP的条件下,经2轮PCR(共60个循环)突变率可>2%。其突变类型有明显偏向性,以A/T的突变为主,转移多于颠换。结论:用致突菌株引入的突变率过低,不适用于抗体亲和力成熟,错配PCR在合适条件下可达到2%以上突变率,适用于随机突变抗体库的构建,但其突变类型有偏向性,应予以考虑。 相似文献
12.
目的 研究替米沙坦对脂多糖诱导3T1-L1脂肪细胞炎症通路的影响,探讨替米沙坦的抗炎机制.方法将3T3-L1脂肪细胞诱导至90%成熟,按随机数字表法分为6组:对照组、LPS组、LPS+替米沙坦(0.01、0.1、1和10μg/ml)组(n=18),向对照组细胞中加DMSO,LPS+替米沙坦组细胞中加入不同浓度替米沙坦,孵育2h后,LPS组和LPS+替米沙坦组再加入脂多糖(1 μg/ml),孵育1h,Western免疫印记法比较各组核蛋白NF-κBp65、总蛋白p-IκBα、IκBα、p-ERK1/2、ERK1/2、P-p38MAPK、p38 MAPK的表达水平.结果 脂多糖刺激后IκBα磷酸化蛋白表达增强(P<0.05),细胞核内NF-κBp65蛋白表达增多(P<0.05),MAPK通路相关蛋白ERK1/2磷酸化和p38MAPK磷酸化水平明显增强(P<0.05),替米沙坦可抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核转位,p-IκBα蛋白表达和核蛋白NF-κBp65表达均降低,大剂量替米沙坦(10 μg/ml)作用时该作用明显(P<0.05).替米沙坦干预后,p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表达也受到明显抑制(P<0.05),大剂量(10μg/ml)时作用明显(P<0.05).结论 在3T3-L1脂肪细胞中,替米沙坦可以抑制NF-κB通路中IκBα蛋白磷酸化、NF-κBp65蛋白核转位以及MAPK通路中ERK1/2蛋白和p38MAPK蛋白的磷酸化,从而发挥抗炎作用. 相似文献
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促肾上腺皮质激素单克隆抗体的筛选和鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的制备促肾上腺皮质激素 ( ACTH)单克隆抗体 ,拟建立高灵敏度 ACTH- IRMA或 EL ISA。方法 ACTH1 - 1 3、ACTH1 - 2 8、ACTH 1 - 39和 ACTH1 8- 39分别与牛血清白蛋白偶联制备免疫原 ,在背部皮下和腹腔注射免疫 BAL B/ c鼠。按常规方法进行细胞融合 ,以 RIA法检测培养上清液 ,阳性孔经亚克隆 ,获得 2株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株 ;瘤细胞种于预致敏的BAL B/ c鼠腹腔 ,批量生产单抗性腹水 ;琼脂扩散法鉴定抗体类型 ;利用标准曲线的参数计算单抗的亲合常数 ;亲合纯化单抗并进行抗体固化试验。结果从 ACTH1 - 2 8免疫鼠获得单抗株为 5 G2 ,从 ACTH1 - 1 3免疫鼠获得单抗株为 D3 ;单抗腹水 5 0 %结合率时腹水最终稀释度分别为 5× 10 3和 2× 10 3;抗体类型均为 Ig G1/λ;5 G2和 D3亲合常数分别为 5 .1× 10 9L M- 1 和 4 .9× 10 7L M- 1 ;抗体包被实验显示 5 G2和 D3的固化抗体量分别为 1.4μg和 8.8μg时结合率达到饱和。结论 5 G2和 D3可以用于构建灵敏的 ACTH- IRMA或 EL ISA。 相似文献
14.
目的:通过突变方法提高抗TNFα单链抗体pscTNF的亲和力。方法:以pscTNF质粒为模板,应用错配PCR构建突变抗体库,筛选亲和力得到改善的变种,再以所获变种为模板,用交替延伸PCR技术,再次构建突变库,筛选活性得到改良的克隆。以斑点ELISA方法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果:从错配PCR抗体库中筛选得到7个活性有所增强的变种,再通过交替延伸PCR使这7个变种的突变位点交换重组,获得了亲和力进一步提高的克隆。结论:联合应用错配PCR和交替延伸PCR法可提高单链抗体亲和力。 相似文献
15.
甲状腺激素对大鼠脾淋巴细胞内ACTH的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
本实验通过药物诱发SD大鼠发生甲亢和甲低,研究甲状激素对脾淋巴细胞内免疫反应性ACTH(irACTH)的影响,甲亢组大鼠体重显著低于甲低组和对照组;血清TT3,FT3,TT4,FT4在甲亢组和甲低组间有显著差异;相同细胞数内irACTH量,甲亢组略高于对照组,而甲低组则显著低于另两组,表明甲状腺激素对淋巴细胞内irACTH的合成有正调节作用。 相似文献
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CDR3突变提高抗TNF-α Fab段的亲和力 总被引:1,自引:0,他引:1
目的通过抗体库技术在CDR3区引入限定性突变以提高抗TNF-α抗体Fab的亲和力。方法首先合成含CDR3区突变的寡核苷酸,限定突变率以保持50%~70%的亲本序列,通过重叠延伸PCR的方法引入突变,构建突变库,再以硫氰酸铵溶液作洗涤液,筛选亲和力得到提高的特异性克隆,用非竞争性ELISA法测定亲和常数。结果从轻链突变库中筛选得到1个活性提高的特异性克隆K8,在第93位发生N→R突变,其亲和常数为2.8×108L/mol,较亲本抗体(0.1×108L/mol)提高了近28倍;从重链突变库中筛选得到多个活性增高的克隆,部分克隆测序显示96、97和100d位置发生R→K、Y→Q、M→L突变的几率最高,且对亲和力提高贡献大。测定了10个变种的亲和常数,分别为0.2×108、0.22×108、1.8×108、3.2×108、3.3×108、3.5×108、3.7×108、4.0×108、6.3×108和6.5×108L/mol,最大的提高了近65倍。结论CDR3区的限定性突变可显著提高抗体亲和力。 相似文献
17.
目的 探讨人白血病相关蛋白16(LRP16)基因对细胞葡萄糖摄取的影响及分子机制.方法 将LRP16基因表达载体pcDNA3.1-16转染3T3-L1脂肪细胞、C2C12成肌细胞和HepG2肝癌细胞,建立LRP16基因高表达细胞系;利用2-脱氧-[~3H]-D-葡萄糖检测LRP16对葡萄糖摄取的影响;免疫印迹法检测LRP16对PPARγ葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)和GLUT-2表达的影响.结果 成功建立LRP16基因高表达细胞系,3组细胞中LRP16表达均为对照细胞的2倍;对照3T3-L1脂肪细胞、C2C12成肌细胞和HepG2肝癌细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取率明显高于LRP16高表达细胞(P<0.01);对照333-L1脂肪细胞、C2C12成肌细胞和HepG2肝癌细胞的PPARγ及GLUT-4或GLUT-2蛋白表达明显高于LRP16高表达细胞(P<0.05).结论 LRP16通过下调PPARγ表达抑制细胞葡萄糖摄取. 相似文献
18.
目的探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦对小鼠3T3-L1脂肪细胞合成白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法脂肪细胞诱导至90%成熟,随机分为5组:对照组,脂多糖(LPS)组,LPS+替米沙坦组,其中替米沙坦设0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml 3个浓度梯度。对照组中加DMSO,LPS+替米沙坦组中加不同浓度替米沙坦,孵育2h后,再向LPS组和LPS+替米沙坦组加入LPS(1μg/ml),与替米沙坦共同孵育细胞1h。酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组IL-6和TNF-α的蛋白分泌水平,Q-PCR检测各组IL-6和TNF-αmRNA基因表达。结果脂多糖处理后IL-6分泌较对照组增加约2.7倍,IL-6mRNA表达增加4倍。替米沙坦干预后各组IL-6浓度较脂多糖组均明显下降,10μg/ml组降低67%,IL-6mRNA表达随替米沙坦浓度升高而下降,10μg/ml组下降约63%。此外,与对照组相比,脂多糖处理组TNF-α分泌增加1.3倍,其mRNA表达增加3.5倍,替米沙坦干预后,各组TNF-α蛋白分泌及mRNA表达均较脂多糖组明显降低,大剂量替米沙坦干预后(10μg/ml),TNF-α蛋白分泌下降约85%,mRNA表达下降约23%。结论替米沙坦通过影响脂肪细胞炎性因子的产生发挥抗炎作用,10μg/ml大剂量时作用尤为明显。 相似文献
19.
目的:观察不同糖耐量阶段血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平,探讨Hcy与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的关系。方法:选择在我院健康查体的83名符合入选标准的个体,行标准口服75g葡萄糖耐量试验,留取空腹血标本测定血脂、肝肾功能、Hcy等指标,留取空腹、服糖后2h血标本测定血糖和胰岛素水平、尿微量白蛋白/肌酐水平。Hcy采用免疫荧光偏振法测定。结果:经糖耐量试验将入选者分为糖耐量正常组(NGT)32例,糖耐量减低组(IGT)24例和新诊断糖尿病组(DM)27例。IGT组和DM组空腹Hcy水平明显高于NGT组(P〈0.01)。IGT组和DM组HOMA-IR显著高于NGT组(P〈0.01),IGT组和DM组ISI显著低于NGT组(P〈0.01),NGT组和IGT组HBCI显著高于DM组(P〈0.01,P〈0.01),经HOMA-IR校正之后,NGT组HBCI/IR显著高于IGT组(P〈0.01)。IGT组FBCI显著高于NGT组和DM组(P〈0.05,P〈0.01),经HOMA-IR校正之后,NGT组FBCI/IR显著高于IGT组和DM组(P〈0.05,P〈0.01),IGT组FBCI显著高于DM组(P〈0.01)。相关分析显示Hcy与ISI(r=-0.335,P=0.030)呈显著负相关,经HOMA-IR校正后,Hcy与HBCI/IR和FBCI/IR呈显著负相关性。多元逐步回归分析显示,腰围、尿Alb/Cr、FINS、HOMA-IR、FBCI和FBCI/IR对Hcy有显著影响。结论:糖耐量受损者其血浆Hcy水平高于糖耐量正常者,胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损与糖耐量异常者血浆Hcy水平明显相关。 相似文献
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目的 以低精蛋白重组人胰岛素注射液(诺和灵N)作为参比制剂,评价重组甘精胰岛素注射液国产制剂(长秀霖)和进口制剂(来得时)的生物等效性.方法 采用随机、单盲、单中心、交叉设计方法对16名健康男性志愿者进行长秀霖和来得时试验,其中6名接受诺和灵N试验.受试者皮下注射胰岛素(0.4 U/kg)后24h内,以葡萄糖钳夹技术维持受试者血糖在5.0 mmol/L左右.结果 与皮下注射诺和灵N相比,皮下注射长秀霖和来得时后,试验中葡萄糖输注率及血清胰岛素浓度在2~4h内迅速上升达到平台期,至注射后24h仍保持较平稳,无明显峰值.长秀霖和来得时组试验中葡萄糖输注率最大值(P<0.01)和血清胰岛素浓度最大值(P<0.05)均明显低于诺和灵N组.经交叉试验设计的多因素方差分析表明,皮下注射长秀霖和来得时组间主要药代动力学参数INS-AUC0~24h、INS-Cmax差异均无统计学意义(P>0. 05).Tmax经非参数检验法的秩和检验差异无统计学意义(P>0. 05).经双单侧t检验及90% CI计算,Ln(AUC0~24h)的90% CI(82.0%~105.2%)为80%~125%,Ln(Cmax)的90% CI(78.9%~107.7%)为70%~143%.结论 长秀霖和来得时均比诺和灵N具有更平稳的降糖效应和更平稳的血清胰岛素浓度,药效学和药代动力学参数统计分析结果表明长秀霖与来得时具有生物等效性. 相似文献