藻酸钙海绵复合转基因骨髓基质干细胞的体外培养

目的采用不同方法制备藻酸钙海绵,观察其与细胞的复合情况。方法将藻酸钠与CaCl2或葡萄糖酸钙混合交联,采用慢速冷冻、酒精脱水或快速冷冻、真空干燥的方法制备藻酸钙海绵,与人胰岛素样生长因子(hIGF-Ⅰ)基因转染的骨髓基质干细胞复合培养,观察标记基因和目的基因的表达。结果CaCl2制备、酒精脱水的藻酸钙海绵韧性与强度最高,孔隙大,分布均匀;葡萄糖酸钙制备、酒精脱水组强度低,孔径小,冻干后质脆,弹性欠佳。复合培养后有增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达。培养基中hIGF-Ⅰ分泌浓度各组互有差异。结论冷冻脱水制备的藻酸钙海绵强度增高,与细胞复合后细胞存活并有目的基因和标记基因表达。     

人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究

[目的]设计一种体外制备、分离人工关节金属磨损颗粒的方法，并验证这种颗粒用于医学实验的可行性。[方法]用钛铝钒合金、钴铬钼合金材料分别制成球磨罐（国家发明专利，申请号：03142073．7），球磨罐内装有用同种材料制成的磨块；向该球磨罐内注入模拟生物体液；震动球磨得到颗粒混悬液。梯度离心获得金属颗粒。对颗粒进行：（1）元素成分鉴定；（2）颗粒大小鉴定和粒度分析；（3）扫描电镜对颗粒的表面形态观察；（4）将颗粒与J774A．1巨噬细胞共同培养，观察细胞吞噬颗粒的情况。[结果]通过此方法成功产生并分离出大量直径1μm左右的钛合金和钴铬钼合金颗粒。（1）元素分析证实整个处理过程中无杂质成分污染；（2）钛合金颗粒的平均直径Dv90：1．009，钴铬钼颗粒的平均直径Dv90：1．008，粒度分布曲线基本成正态；（3）扫描电镜图象显示颗粒大小均匀，形状多为不规则，与体内颗粒极为相似；（4）J774A．1巨噬细胞能完整吞噬2种材料的颗粒。[结论]此方法能持续大量产生人工关节假体金属材料的磨损颗粒，产生的颗粒能在各方面很好地模拟体内磨损颗粒，为今后人工关节假体松动相关研究的体内、体外研究提供可靠的颗粒来源。     

长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响

目的通过观察长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,鉴定ADSCs作为组织工程种子细胞的优越性。方法通过流式细胞技术观察长期体外培养对人ADSCs表面抗原表达和凋亡的影响。通过碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及RT-PCR检测长期体外培养对人ADSCs成骨分化潜能的影响。结果原代ADSCs表面高表达间充质干细胞表面标记物,而不表达血源性细胞表面标记物,标记物不随传代次数变化。早期ADSCs凋亡率为1%～2%,随传代次数增多凋亡率逐渐增加．但幅度不大。碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色和RT-PCR检测显示ADSCs传至第8代时仍能保持成骨分化潜能。结论ADSCs生物学特性稳定,是较为理想的组织工程及再生医学研究的种子细胞。     

人负重关节软骨细胞的体外分离与培养

目的　研究人负重关节软骨细胞的分离培养技术。方法　对 10例手术切除的负重关节软骨进行0 2 %Ⅱ型胶原酶分离、10 %DMEM中培养 ,观察软骨细胞获得率、贴壁率、增殖状况及形态学改变。结果　① 0 2 %Ⅱ型胶原酶消化尽 2 0 0～ 70 0mg软骨标本需 4～ 14h ,细胞获得率 (1 82± 0 5 7)× 10 6/g ,存活率(79 4± 9 9) %。②细胞可传 6～ 12代 ,前 4代培养时间平均 (33± 10 )d ,生长倍数平均 198倍 ,倍增时间(4 13± 1 34)d。③第 3、4代细胞呈多角形、部分梭形 ,8、9代后细胞梭状铺平。结论　 30 0～ 5 0 0mg软骨标本 ,经该方法培养 3～ 4周后可达第 4代 ,细胞数可达 (0 6～ 1 0 )× 10 8个 ,可满足临床上修复 15～ 2 5cm2软骨缺损的需要。     

重组人BMP-2骨诱导中神经生长因子的表达

目的通过观察重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)异位诱导成骨过程中神经生长因子(NGF)的表达,探讨NGF在BMP骨诱导中的作用.方法采用ICR小鼠48只,随机分为实验组和对照组,行右侧股后部肌袋异位成骨模型,实验组植入含0.125 mg rhBMP-2胶原海绵复合物,对照组仅植入相同体积胶原海绵,分别于术后3、7、14、21 d取材,进行放射学、组织学及免疫组化检测.结果放射学和组织学检测均证实,rhBMP-2胶原海绵复合物具有良好的诱导成骨能力;术后第7 d,在软骨大量形成期,NGF阳性染色达到高峰,在成纤维细胞、软骨前体细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞和成骨细胞中均有阳性表达;术后14、21 d,阳性细胞数量和染色强度有所回落.对照组未见成骨现象.结论首次证实在外源性BMP诱导成骨过程中有明显的NGF表达,提示NGF可能通过直接或间接的方式参与并协同BMP的诱导成骨过程.     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4诱导新鲜异体骨移植免疫耐受的实验研究

目的　利用外源性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 ( cytotoxic T lymphocyte- associated antigen 4immuno globlin,CTL A4 - Ig)阻断T细胞反应的第2信号,诱导新鲜同种异体骨移植免疫耐受。　方法　采用近交系小鼠BAL B/C 6 6只作为骨移植的受体,进行异位肌袋一次及第2次骨移植。一次移植分为3组,每组18只,一组移植C5 7BL/6小鼠骨骼,注射L6 (对照品) ,为AL组;一组移植C5 7BL/6小鼠骨骼,注射CTL A4 - Ig,为AC组;一组移植同系BAL B/C小鼠骨骼,注射PBS缓冲液,为AB组。在第2、4及6周,进行血淋巴细胞亚群分析,血清抗体测定,供体细胞及抗原二次刺激实验及组织学观察。另取12只BAL B/C小鼠,进行第2次移植实验,供体为C5 7BL/6小鼠的骨骼,注射CTL A4 - Ig后2周,分别移植C5 7BL/6 ( BC组)和C3H( BH组)小鼠的骨骼,检测产生免疫耐受的特异性。　结果　AL组与AB组比较,产生了强烈的免疫排斥反应,移植后2、4及6周,CD4 T细胞的增殖明显增加( P<0 .0 5 ) ,血清抗体明显增多( P<0 .0 5 ) ,供体细胞及骨抗原二次刺激的细胞增殖也明显增加( P<0 .0 5 ) ;AC组免疫排斥反应较轻,在CD4 T细胞的增殖、血清抗体及二次刺激的细胞增殖方面均与AB组相似( P>0 .0 5 ) ;组织学观察也显示,异体骨周围的淋巴细胞浸润消失,软骨诱导及新骨形     

VEGF-D在乳腺癌淋巴管生成中的作用及与预后的关系

目的 探讨血管内皮生长因子D(VEGF-D)在乳腺癌淋巴管生成中的作用及其与临床病理指标及预后的关系.方法 采用免疫组化法检测85例原发性乳腺癌VEGF-D的表达,以Podoplanin标记淋巴管内皮、计数淋巴管密度(LVD),采用RT-PCR法检测VEGF-D mRNA的表达.分析上述指标与临床病理指标及预后的关系.结果 免疫组化检测显示,VEGF-D蛋白表达阴性5例(5.88%)、"+"17例(20%)、"++"34例(40%)、 "+++"22例(25.88%)、"++++"7例(8.24%),其表达与淋巴结转移、临床分期相关(P《0.01),且导致较差的生存率(P《0.05).LVD于不同表达程度的VEGF-D组间有显著差异(P《0.01),且随着VEGF-D表达的增加,LVD有上升的趋势.RT-PCR 检测显示,VEGF-D mRNA在乳腺癌中的表达显著高于对照组(P《0.01),且其表达与淋巴结转移、临床分期和LVD相关(P《0.05).结论 VEGF-D在乳腺癌中具有一定的诱导淋巴管生成的作用,并与肿瘤的淋巴侵袭转移及预后相关.     

纯化海藻酸钠在间充质干细胞微囊化中的应用

目的应用纯化海藻酸钠(PSA)制备间充质干细胞(MSCs)的微胶囊。方法制备MSCs细胞悬液,MTT法分别测定PSA或海藻酸钠(SA)处理对MSCs增殖的影响。分别以PSA和SA为囊材,制备MSCs的海藻酸钠-聚赖氨酸微囊。倒置显微镜下观察微囊形态;以微胶囊破损率为指标考察其机械强度;EB/Calcein-AM染色并于荧光显微镜下分析微囊化细胞存活率。SD大鼠体内移植试验对比不同回收时间点两种微囊的完整性和囊周纤维化程度。结果MTT法测定结果显示,PSA处理组MSCs的吸光度值明显高于SA处理组。与SA制备的微囊比较,PSA制备的微囊粒径均匀,微囊膜破损率较低,不同时间点的细胞存活率回升明显。SD大鼠体内移植试验显示,SA组回收微囊约25%破损,而PSA组回收微囊的破损率<10%。同时,PSA组囊周纤维化程度低于SA组。结论PSA可应用于MSCs的微囊化中,其具有机械强度高及生物相容性好的优点。     

β-半乳糖苷酶在体内外成骨细胞中的表达

目的 研究β—半乳糖苷酶(β—gal)在成骨细胞中的表达状况，为阐明MorquioB综合征的发病机制提供依据。方法 裸鼠各器官和骨组织标本行X-gal染色检测。抽取羊和人骨髓行骨髓基质细胞(BMSCs)培养，分为4组：I：Adv-hBMP-2转染组；Ⅱ：Adv—β—gal转染组；Ⅲ：未转染组；Ⅳ：地塞米松诱导组。分别行X-gal染色和RT-PCR检测β—gal的表达。结果 裸鼠骺板两侧、骨膜内面及松质骨的成骨细胞和破骨细胞可见多量β—gal的表达。未转染BMSCs组有少量β—gal的表达，其他3组细胞的β—gal表达增高。结论成骨细胞和破骨细胞可表达多量β—gal，该两种细胞的β—gal缺乏可能是MorquioB综合征骨骼异常的直接原因。     

补肾富钙中药对大鼠卵巢辐射损伤所致骨质疏松形态

目的 探讨补肾富钙中药对大鼠卵巢辐射损伤所致骨质疏松形态计量学的影响.方法 40只SD大鼠随机分为四组(n=10),分别为假手术组(灌服1%纤维素90 d)、模型组(以50 Gy γ射线局部照射大鼠卵巢建立卵巢辐射损伤模型,1%纤维素灌服90 d)、尼尔雌醇组(造模后给予尼尔雌醇灌胃90 d)和补肾富钙中药组(造模后给予补肾富钙中药灌胃90 d).各组大鼠于处死前第14天和第4天分别腹腔注射盐酸四环素(30 mg/kg)进行标记,处死后取右侧股骨组织和L4腰椎组织分别进行骨组织形态计量和扫描电镜观察.结果 与模型组比较,补肾富钙中药组和尼尔雌醇组的骨小梁体积显著增加,骨吸收表面减少;尼尔雌醇组的骨形成表面和矿化沉积率下降,但在补肾富钙中药组则无显著变化.扫描电镜观察显示,模型组骨小梁变细、中断、排列稀疏,而补肾富钙中药组和尼尔雌醇组上述变化较轻微.结论 补肾富钙中药可有效预防卵巢辐射损伤诱发的骨质疏松.