透明质酸复合BMP-2转染的兔骨髓基质干细胞在裸鼠肌内成骨的实验研究

我们通过动物实验，对高分子量透明质酸(hyaluronic acid，HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2基因(Adv-hBMP-2)体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs)裸鼠肌内成骨与成软骨能力进行了观察。     

改良大鼠气囊模型在人工关节假体松动研究中的应用

[目的]设计并改良大鼠气囊模型（the air pouch model），证实该模型在人工关节松动相关研究中的应用价值。[方法]（1）改良大鼠气囊模型的建立：健康成年SD大鼠18只，背部皮下注入空气20ml，48h后补充注入空气10ml形成气囊。形成气囊24h后气囊穿刺，注入PBS液5ml，6、24、48h分别穿刺抽液，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF—Ot；（2）改良大鼠气囊模型对不同关节材料磨损颗粒生物反应的比较：健康成年SD大鼠24只，皮下充气造模后将钴铬钼、钛铝钒和钛铌锆合金（TNZ）颗粒混悬液注入气囊，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF—α，用囊壁组织学切片进行炎症细胞反应分级并测量囊壁厚度。[结果]（1）在SD大鼠皮下注入空气20ml可以形成饱满的气囊，大鼠术后活动正常。48h后气囊由于气体吸收体积减小，张力下降。再次注射10ml空气后张力恢复。PBS能使囊内液体的TNF—α在6h左右出现一个高峰达239．30pg／ml，与24h和48h比较，差异有显著统计学意义（P〈0．05）。IL-6的测定值没有TNF—α那样的6h分泌高峰。6、24、48h之间无显著性差异（P〉0．05）；（2）钻铬钼、钛铝钒、TNZ3种颗粒注入气囊48h后都能引起TNF—α分泌量显著升高（P〈0．05），两两比较，钛铝钒组明显高于钴铬钼组和TNZ组（P〈0．05）。3种材料均不能引起IL-6分泌的显著增加（P〉0．05）。TNZ组气囊囊壁厚度明显小于钴铬钼组和钛铝钒组（P〈0．001）。[结论]改良大鼠气囊模型具有造模简单、对人工关节颗粒反应快速敏感的特点，是一种人工关节松动相关实验研究有效的动物模型。     

不同强度张应力刺激影响关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的研究

目的观察不同强度张应力刺激对人体体外培养的关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的影响。方法获取因股骨颈骨折行髋关节置换术患者的股骨头关节软骨细胞。对第一代关节软骨细胞分别施加强度为3%、6%、15%延伸率的张应力刺激,张应力刺激后提取细胞的总RNA,进一步逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达。结果虽然3%和6%的张应力刺激均可增加Ⅱ型胶原mRNA的表达,但没有统计学意义;15%的张应力刺激能明显抑制Ⅱ型胶原mRNA的表达,且有统计学意义。尽管张应力刺激均可增加聚集蛋白聚糖mRNA的表达,但均没有统计学意义(P0.05)。结论不同强度的张应力刺激对关节软骨细胞表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的影响不同。15%延伸率的张应力刺激可明显抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原基因的表达,但不能明显改变聚集蛋白聚糖基因的表达,这可能与关节软骨细胞的功能适应性有关。     

转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。     

适宜组织工程化骨构建的流体剪切力和物质转运速度的研究

目的 探讨适宜组织工程化骨构建的流体剪切力和物质转运速度.方法 对接种人骨髓间质干细胞的多孔β-磷酸三钙支架进行灌注培养.灌流量相同时,对支架上的细胞分别施加1×、2×及3×的流体剪切力;流体剪切力相同时,分别给予3ml/min、6 ml/min和9 ml/min的灌注.细胞增殖采用MTT法,通过检测碱性磷酸酶(alkalilinphosphatase,AKP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OP)、骨钙素(osteocalcin,OC)分泌及细胞外基质的矿化评价组织工程化骨的构建.通过计算流体动力学得出流体剪切力和物质转运速度.结果 灌流量相同时,剪切力2×组细胞增殖活性最高;2×和3×组AKP活性及OC分泌高于1×组;第28天时,3×组矿化基质最多.流体剪切力相同时,6 ml/min组AKP活性最高;第28天时,3 ml/min组OC分泌最高,矿化基质最多.灌流量相同时,流体剪切力分别为0.004～0.007 Pa、0.009～0.013 Pa和0.013～0.018 Pa;流体剪切力相同时,物质转运速度分别为0.267～0.384 mm/s、0.521～0.765mm/s和0.765～1.177 mm/s.结论 利用接种人骨髓间质干细胞的β-磷酸三钙支架构建组织工程化骨时,0.013～0.018 Pa的流体剪切力及0.267～0.384 mm/s的物质转运速度是适宜的.

Abstract：

Objective To explore the optimum flow shear stress and mass transport for the construction of tissue-engineered bone.Methods The β-tricalcium phosphate (β-TCP) scaffolds seeded with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (HBMMSCs) were cultured in perfusion bioreactor.When the same flow rate was applied,the flow shear stress was separately 1×,2× and 3×.When the same flow shear stress was applied,the flow rates were separately 3 ml/min,6 ml/min and 9 ml/min.Cell proliferation was measured by MTT method.The construction of tissue-engineered bone was evaluated by measuring alkaline phosphatase (AKP) activity,secretion of osteopontin (OP) and osteocalcin (OC),and the mineralization of extracellular matrix (ECM).The flow shear stress and the mass transport were obtained using computational fluid dynamics.Results When the flow rate was same,the most cell proliferation was found in 2× group.The AKP activity and secretion of OC was higher in 2× and 3× groups than in those in 1× group.After 28days,the highest amount of mineralization of ECM was found in 3× group.When the flow shear stress was same,the AKP activity was highest in 6 ml/min group.After 28 days,secretion of OC and formation of mineralized ECM was highest in 3 ml/min group.When the flow rate was same,the flow shear stress was separately 0.004-0.007 Pa,0.009-0.013 Pa and 0.013-0.018 Pa.When the flow shear stress was same,the flow rate was separately 0.267-0.384 mm/s,0.521-0.765 mm/s and 0.765-1.177 mm/s.Conclusion When the tissue-engineered bone was constructed,0.013-0.018 Pa flow shear stress and 0.267-0.384 mm/s mass transport velocity could improve the construction of the tissue-engineered bone in vitro.     

冻干同种与异种骨移植免疫反应的比较研究

目的: 通过比较冻干同种与异种骨移植免疫反应, 探讨异种骨移植排斥机制。方法: 取C57BL/6小鼠 10只和新西兰兔 1只, 分别为同种和异种骨供体, 通过处理制成冻干骨。取 40只BALB/c小鼠为骨移植受体, 随机分为A、B两组 (每组 20只), 分别在其股后肌袋植入冻干同种和冻干异种骨。分别于术后 1、2、4、6周分批取材检测。通过观察术后受者的淋巴细胞刺激指数、淋巴细胞亚群分析、细胞因子产生及组织学表现, 比较冻干同种与异种骨移植免疫反应。结果: 冻干异种骨移植组的细胞刺激反应在各不同时期均比同种组强 (P<0. 05 ), 而且其CD4 和CD8 T细胞亚群及IL 2分泌均高于同种组 (P<0. 05)。组织学检查也表明其细胞浸润多、成骨少。结论: 冻干同种与异种骨移植排斥机制基本相同, 二者均以Th1反应为主, 但异种骨移植排斥反应较强。     

可注射性藻酸钙凝胶修复整合兔膝关节骨软骨缺损实验研究

目的: 使用骨髓基质干细胞 (BMSCs)、藻酸钙及两种生长因子, 修复兔股骨内髁负重区骨软骨缺损, 寻找合适的关节骨软骨缺损修复方法。方法: 将藻酸钙、体外培养扩增的自体BMSCs及IGF I TGF β复合材料注射于兔膝关节股骨内髁负重区上的骨软骨缺损。结果: BMSCs在藻酸钙中能分化为软骨细胞和成骨细胞, 材料无毒副作用; 关节骨软骨缺损后注入BMSCs 藻酸钙 IGF I TGF β复合体, 各期修复较对照组均有统计学意义 (P<0. 05)。结论: 藻酸钙能为BMSCs提供良好三维生长环境并能使之保持正常形态; BMSCs 藻酸钙 IGF I TGF β复合体能用于关节骨软骨急性缺损修复, 形成正常透明软骨样结构, 软骨下骨修复良好。     

IL-4与IL-10联合诱导异种骨移植免疫耐受的实验研究

[目的]探讨IL-4和IL-10在诱导异种骨移植免疫耐受中的作用。[方法]取雄性BALB／c小鼠60只（体重20～22g）为骨移植受体，取新西兰兔1只为异种骨供体。实验用小鼠股后肌袋骨移植模型。将动物随机等分为A、B、C 3组，在小鼠左肢股后肌袋植入新鲜异种骨粒（75mg／只）并做如下处理。A组为对照组，腹腔注射生理盐水200 μl；B组腹腔注射IL-4和IL-10各0．5 μg（100 μl）；C组植骨部注射IL-4和IL-10各0．5 μg（100 μl）。于术后1、2、4、6周分批取材。通过检测受者的淋巴细胞刺激指数、细胞因子及组织学变化，观察诱导异种骨移植免疫耐受的效果。另取BALB／c小鼠10只和本地菜兔1只做二次移植实验，确定免疫抑制作用是否有供体特异性。[结果]与A组相比，B和C组注射IL-4及IL-10后均明显抑制了骨抗原二次刺激引起的细胞增殖（P〈0．01），腹腔注射起效早，局部注射作用持久。细胞因子检测，早期B组IL-2和IFN-γ分泌增加（P〈0．05），C组仅IFN-γ分泌增加；2周时两组的IFN-γ和IL-4分泌均明显减少（P〈0．05），C组的IL-2分泌也明显减少（P〈0．001）。组织学检查，注射IL-4和IL-10后植骨部炎细胞浸润少，尤其C组诱导成骨较多。二次移植实验表明，IL4和IL-10的免疫抑制作用有供体抗原特异性。[结论]IL-4和IL-10能有效抑制新鲜异种骨移植免疫反应，促进耐受形成。抑制作用在早期主要通过细胞因子调节，使Th1／Th2达到动态平衡而实现。腹腔注射起效早，局部注射作用持久。     

人胰岛素样生长因子I基因转染骨髓基质细胞的实验研究

目的检测人胰岛样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的效果及目的基因的表达情况,寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法。方法抽取成年雄性山羊髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质细胞,检测细胞生长特性。取第2代细胞,按3∶1比例用FuGene6转染试剂介导,将重组真核表达质粒pIRES2 EGFP hIGF Ⅰ(EGFP为增强绿色荧光蛋白,hIGF Ⅰ为人胰岛素样生长因子Ⅰ)转染骨髓基质细胞,转染后4~72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达情况,计算转染效率。酶联免疫吸附试验检测培养上清液中hIGF Ⅰ的浓度变化。转染细胞爬片行hIGF Ⅰ免疫组化染色检测hIGF Ⅰ的表达。提取转染后48h的细胞总RNA,RT PCR检测hIGF Ⅰ和内核糖体进入位点(IRES)的表达。收集转染前及转染后48h的细胞行流式细胞仪检测细胞周期分布及荧光表达情况。结果成年山羊骨髓基质细胞在接种后24h开始贴壁,伸展成长梭形,原代细胞呈集簇状分布。在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰, 72h时见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达。转染后4~72h转染上清液中分泌hIGF Ⅰ的浓度呈逐渐上升趋势,在72h最高可达34 75ng/ml。转染后部分细胞形态发生变化。hIGF Ⅰ免疫组化染色证实在胞浆中     

透明质酸复合人骨形态发生蛋白-2转染兔骨髓基质干细胞的体内外成骨研究

目的观察透明质酸(HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白(AdvhBMP)2基因转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的体内外诱导成骨活性。方法(1)体外成骨活性研究方法分成4组,AdvhBMP2转染细胞 HA组、AdvhBMP2转染细胞组、未转染细胞 HA组和未转染细胞组,采用免疫沉淀法(IP)、Western印迹法检测hBMP2表达、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测骨涎蛋白mRNA表达、ALP和vonKossa染色及ALP定量检测;(2)裸鼠肌内诱导成骨实验裸鼠12只(共24侧)分4组注射AdvhBMP2转染细胞 HA组(n=8)、注射AdvhBMP2转染细胞组(n=8)、注射未转染细胞组(n=4)和单纯注射HA组(n=4),观察方法采用X线、成骨计量对照、组织学观察法。结果(1)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组BMSCs表达hBMP2和骨涎蛋白mRNA,两组的ALP活性均高于未转染细胞 HA组和未转染细胞组(P<0.01),并有明显的钙结节形成;(2)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组均有成骨,两组差异有显著性(P<0.01),未转染细胞和单纯注射HA组均未见成骨,局部以纤维和脂肪组织为主。结论HA复合AdvhBMP2基因转染的BMSCs在体外有较好的诱导成骨活性,在裸鼠肌内有良好的诱导成骨和成软骨的作用,是可注射性的骨缺损修复方法。