细胞微囊技术在再生医学领域的应用

细胞微囊具有良好的免疫隔离作用.微囊体内移植仍面临炎性细胞浸润和纤维化包襄的难题,微囊制备、材料选择及体内移植部位对提高其生物相容性尤为重要.目前细胞微囊化技术在再生医学领域的应用受到广泛重视,转基因干细胞微囊化后可持续分泌组织再生所需生长因子,微囊创造的微环境也为干细胞分化提供了有利场所.     

表皮葡萄球菌生物膜蛋白在假体周围感染诊断中的应用

目的探讨表皮葡萄球菌生物膜蛋白作为抗原诊断假体周围感染的临床价值。方法制作表皮葡萄球菌感染的假体周围感染动物模型，并收集临床假体周围感染患者的血清。以从表皮葡萄球菌444生物膜中提取的蛋白为抗原，用ELISA方法检测感染动物和临床假体周围感染患者的血清中IgG水平。蛋白印迹杂交寻找特异性抗原蛋白。结果感染动物和感染患者血清中的IgG水平明显高于各自对照组，Western—blot结果显示，表皮葡萄球菌生物膜蛋白大小在15KD-37KD之间具有良好的抗原性。结论表皮葡萄球菌生物膜蛋白成份具有良好的抗原性，是引起机体免疫的重要成份。进一步纯化这些蛋白组分并作为诊断假体周围表皮葡萄球菌感染的抗原，具有重要的临床价值。     

骨科转化型研究

鉴于公众、决策者和研究资助机构都在呼吁研究转化工作的重要性,美国联邦政府积极响应了美国国家卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)关于医学转化研究的"倡议路线图".就此,刚卸任的美国骨科研究学会(Orthopaedic Research Society,ORS)主席、美国芝加哥Rush大学医学中心骨科教授Joshua J.Jacobs就在美国ORS主办的<骨科研究杂志>(Journal of Orthopaedic Research,JOR)上发表了题为"转化型研究:美国ORS该往何处去?(TranslationaJ Research: Whither the ORS?)"一文,以呼应NIH关于医学转化研究的倡议.该文对骨科疾病多学科研究方向的确立和相关领域发展政策的建立或调整都具有广泛的指导意义和参考价值.     

改良大鼠气囊模型在人工关节假体松动研究中的应用

[目的]设计并改良大鼠气囊模型（the air pouch model），证实该模型在人工关节松动相关研究中的应用价值。[方法]（1）改良大鼠气囊模型的建立：健康成年SD大鼠18只，背部皮下注入空气20ml，48h后补充注入空气10ml形成气囊。形成气囊24h后气囊穿刺，注入PBS液5ml，6、24、48h分别穿刺抽液，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF—Ot；（2）改良大鼠气囊模型对不同关节材料磨损颗粒生物反应的比较：健康成年SD大鼠24只，皮下充气造模后将钴铬钼、钛铝钒和钛铌锆合金（TNZ）颗粒混悬液注入气囊，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF—α，用囊壁组织学切片进行炎症细胞反应分级并测量囊壁厚度。[结果]（1）在SD大鼠皮下注入空气20ml可以形成饱满的气囊，大鼠术后活动正常。48h后气囊由于气体吸收体积减小，张力下降。再次注射10ml空气后张力恢复。PBS能使囊内液体的TNF—α在6h左右出现一个高峰达239．30pg／ml，与24h和48h比较，差异有显著统计学意义（P〈0．05）。IL-6的测定值没有TNF—α那样的6h分泌高峰。6、24、48h之间无显著性差异（P〉0．05）；（2）钻铬钼、钛铝钒、TNZ3种颗粒注入气囊48h后都能引起TNF—α分泌量显著升高（P〈0．05），两两比较，钛铝钒组明显高于钴铬钼组和TNZ组（P〈0．05）。3种材料均不能引起IL-6分泌的显著增加（P〉0．05）。TNZ组气囊囊壁厚度明显小于钴铬钼组和钛铝钒组（P〈0．001）。[结论]改良大鼠气囊模型具有造模简单、对人工关节颗粒反应快速敏感的特点，是一种人工关节松动相关实验研究有效的动物模型。     

大鼠皮质骨上机械性显微损伤的修复机制研究

目的研究大鼠皮质骨上植入物造成的机械性显微损伤的修复机制。方法 30只SD大鼠随机分为两组,一组行卵巢切除术,另一组行假手术。3个月后在右侧胫骨行钻孔术,分别于钻孔后1、2、4周后处死,处死前注射四环素和钙黄绿素进行标记。将含有钻孔的骨段(1 cm)应用大块碱性品红染色,甲基丙烯酸甲酯包埋后切成约50μm厚的切片。应用Bioquant图象分析系统对切片进行骨形态计量学分析。结果去卵巢大鼠和假手术大鼠都出现了与显微损伤有关的骨吸收腔,其中去卵巢组的孔隙率和骨吸收腔明显高于假手术组(P<0.05);随着术后时间的延长,吸收腔的数目逐渐增加,各时间点之间的差异有明显的统计学意义(P<0.05)。结论去卵巢大鼠的孔隙率和骨吸收腔数明显高于假手术大鼠,反映了在雌激素缺乏和较多裂纹形成两种因素刺激下,去卵巢大鼠皮质骨内的重建更为活跃,这会降低骨的强度从而增加骨折的危险性。     

适宜组织工程化骨构建的流体剪切力和物质转运速度的研究

目的 探讨适宜组织工程化骨构建的流体剪切力和物质转运速度.方法 对接种人骨髓间质干细胞的多孔β-磷酸三钙支架进行灌注培养.灌流量相同时,对支架上的细胞分别施加1×、2×及3×的流体剪切力;流体剪切力相同时,分别给予3ml/min、6 ml/min和9 ml/min的灌注.细胞增殖采用MTT法,通过检测碱性磷酸酶(alkalilinphosphatase,AKP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OP)、骨钙素(osteocalcin,OC)分泌及细胞外基质的矿化评价组织工程化骨的构建.通过计算流体动力学得出流体剪切力和物质转运速度.结果 灌流量相同时,剪切力2×组细胞增殖活性最高;2×和3×组AKP活性及OC分泌高于1×组;第28天时,3×组矿化基质最多.流体剪切力相同时,6 ml/min组AKP活性最高;第28天时,3 ml/min组OC分泌最高,矿化基质最多.灌流量相同时,流体剪切力分别为0.004～0.007 Pa、0.009～0.013 Pa和0.013～0.018 Pa;流体剪切力相同时,物质转运速度分别为0.267～0.384 mm/s、0.521～0.765mm/s和0.765～1.177 mm/s.结论 利用接种人骨髓间质干细胞的β-磷酸三钙支架构建组织工程化骨时,0.013～0.018 Pa的流体剪切力及0.267～0.384 mm/s的物质转运速度是适宜的.

Abstract：

Objective To explore the optimum flow shear stress and mass transport for the construction of tissue-engineered bone.Methods The β-tricalcium phosphate (β-TCP) scaffolds seeded with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (HBMMSCs) were cultured in perfusion bioreactor.When the same flow rate was applied,the flow shear stress was separately 1×,2× and 3×.When the same flow shear stress was applied,the flow rates were separately 3 ml/min,6 ml/min and 9 ml/min.Cell proliferation was measured by MTT method.The construction of tissue-engineered bone was evaluated by measuring alkaline phosphatase (AKP) activity,secretion of osteopontin (OP) and osteocalcin (OC),and the mineralization of extracellular matrix (ECM).The flow shear stress and the mass transport were obtained using computational fluid dynamics.Results When the flow rate was same,the most cell proliferation was found in 2× group.The AKP activity and secretion of OC was higher in 2× and 3× groups than in those in 1× group.After 28days,the highest amount of mineralization of ECM was found in 3× group.When the flow shear stress was same,the AKP activity was highest in 6 ml/min group.After 28 days,secretion of OC and formation of mineralized ECM was highest in 3 ml/min group.When the flow rate was same,the flow shear stress was separately 0.004-0.007 Pa,0.009-0.013 Pa and 0.013-0.018 Pa.When the flow shear stress was same,the flow rate was separately 0.267-0.384 mm/s,0.521-0.765 mm/s and 0.765-1.177 mm/s.Conclusion When the tissue-engineered bone was constructed,0.013-0.018 Pa flow shear stress and 0.267-0.384 mm/s mass transport velocity could improve the construction of the tissue-engineered bone in vitro.     

三维动态灌注法构建大段组织工程化骨修复羊胫骨干节段性缺损

[目的]观察三维动态灌注法构建的大段组织工程化骨修复羊胫骨干节段性骨缺损的效果.[方法]利用自行设计的灌注型生物反应器对复合骨髓基质干细胞的大段磷酸三钙柱状载体进行动态灌注培养或静态培养2周,通过葡萄糖日耗量、乳酸生成量监测细胞在载体内的扩增.在羊胫骨干节段性骨缺损中分别植入β磷酸三钙、静态培养和动态灌注培养的组织工程化骨,通过X线片、大体观察、硬组织切片和形态计量学检查观察其修复骨缺损的效果.[结果]动态培养法葡萄糖日耗量及乳酸生成量明显高于静态培养法.单纯β磷酸三钙、静态培养和动态灌注培养的组织工程化骨植入骨缺损16周后的临床愈合率分别为0/6、2/6、4/6.动态灌注培养组的材料残余率明显低于单存材料组(P<0.05).[结论]三维动态灌注培养法构建的大段组织工程化骨修复羊长骨节段性缺损的效果优于传统静态培养法.     

流体动力学因素对大段组织工程骨构建作用的实验研究

目的 研究灌注式生物反应器中流体剪切力和物质转运在大段组织工程骨构建过程中的作用. 方法 抽取健康志愿者髂嵴处骨髓20 mL,分离、培养hBMSCs.将第3代hBMSCs与大段β-TCP支架复合后,在灌注式生物反应器中灌注培养28 d.灌注过程中,通过改变培养基黏度或灌流量,对接种在支架上的hBMSCs施加不同流体剪切力(1、2、3倍)或给予不同速率(3、6、9 mL/min)的物质转运.培养结束后,对接种在支架上的细胞行增殖及ALP活性检测,同时对细胞/支架复合体进行组织学观察及形态学计量. 结果 灌流量均为3 mL/min时,流体剪切力2倍组的细胞活性高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05);当流体剪切力均为3倍时,3、6、9 mL/min灌流量组细胞活性差异无统计学意义(P>0.05).当灌流量均为3 mL/min时,流体剪切力2倍组和3倍组的ALP活性高于1倍组,差异有统计学意义(P<0.05);当流体剪切力均为3倍时,灌流量为6 mL/min组的ALP活性最高(P<0.05).灌注培养28 d后,各组ECM分布于整个β-TCP支架内,灌流量均为3 mL/min时,增加流体剪切力有利于支架内ECM形成及矿化;当流体剪切力均为3倍时,增加灌流量使ECM的矿化减少. 结论 流体剪切力和物质转运两个流体动力学参数是影响大段组织工程骨构建的重要因素.在构建大段组织工程骨过程中,应调节流体动力学参数使其对组织工程骨的构建发挥最佳效应.     

不同强度张应力刺激影响关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的研究

目的观察不同强度张应力刺激对人体体外培养的关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的影响。方法获取因股骨颈骨折行髋关节置换术患者的股骨头关节软骨细胞。对第一代关节软骨细胞分别施加强度为3%、6%、15%延伸率的张应力刺激,张应力刺激后提取细胞的总RNA,进一步逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达。结果虽然3%和6%的张应力刺激均可增加Ⅱ型胶原mRNA的表达,但没有统计学意义;15%的张应力刺激能明显抑制Ⅱ型胶原mRNA的表达,且有统计学意义。尽管张应力刺激均可增加聚集蛋白聚糖mRNA的表达,但均没有统计学意义(P0.05)。结论不同强度的张应力刺激对关节软骨细胞表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的影响不同。15%延伸率的张应力刺激可明显抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原基因的表达,但不能明显改变聚集蛋白聚糖基因的表达,这可能与关节软骨细胞的功能适应性有关。     

Effects of cyclic tensile strain onβ-actin mRNA expression in articular chondrocytes

Objective To investigate the effects of cyclic tensile strain on β- actin mRNA expression in articular chondrocytes.Methods The normal and articular chondrocytes with osteoarthritis were obtained and exposed to 3% , 6% and 15% cyclic tensile strains, respectively.The real-time quantitative PCR was used to determine the altered expressions of the P-actin mRNA under different cyclic tensile strains.Results Both 6% and 15% cyclic tensile strains significantly up-regulated the β-actin mRNA expressions (1.34±0.05, 1.36±0.04, P＜0.05) in normal articular chondrocytes, whereas only 15% cyclic tensile strain was shown to be associated with up-regulated β-actin mRNA expressions in articular chondrocytes with osteoarthritis.Conclusions The β-actin mRNA expressions of articular chondrocytes may change along with different level of cyclic tensile strains.Reaction of articular chondrocytes to cyclic tensile strains may vary under different internal or external circumstances.Therefore, the β-actin appears ineligible as a housekeeping gene in studies on biomechanical of chondrocytes.