可注射壳聚糖-β-磷酸三钙复合富血小板血浆的骨修复作用

目的 以新型可注射生物材料壳聚糖-β-磷酸三钙(β-TCP)为支架,负载富血小板血浆(PRP)构建成复合体,观察其体内成骨效应.方法 18只中国青山羊随机分为三组,每组6只,建立双侧胫骨平台下腔穴型骨缺损模型.空白组:骨缺损部不植入任何牛物材料;单纯材料组:单纯植入可注射生物材料壳聚糖-β-TCP;PRP组:植人复合PRP的壳聚糖-B-TCP.于术后第4、8周取出骨缺损区标本进行大体、绀织学切片观察,图像分析骨缺损区域骨组织的牛成比例. 结果大体标本显示4、8 周时PRP组骨缺损部硬度均强于空白组、单纯材料组.组织切片显爪空白组到8 周时骨缺损区域仍未修复,仅在骨缺损边缘部分区域有少苗类骨质形成,骨缺损区域多为纤维组织填允;单纯材料组骨缺损边缘区域有少量类骨质形成,骨缺损区域多为小的点片状新牛骨组织,中央区域到8周时无明显新生骨组织形成;PRP组骨缺损边缘区域类骨质较单纯材料组增多,骨缺损中间部多为点片状新牛骨助织,骨缺损中央区同中间部相似,见点片状新生骨组织.术后4周空白组、单纯材料组、PRP组的成骨面积百分比分别为(8.79±3.63)%、(14.49±3.72)%、(24.18±5.38)%,8周时分别为(15.41±4.21)%、(25.36±5.37)%、(30.71 ±4.39)%,4周、8周PRP组骨修复效果均优于其他两组(P＜0.05). 结论负载PRP的壳聚糖-β-TCP具有良好的骨修复效果,PRP在体内早期对骨组织修复有促进作用.     

血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对局部血管内皮生长因了(VEGF)表达的影响.方法 将兔自体骨髓基质下细胞经诱导后与β-磷酸三钙材料复合,植入制备的兔股骨缺损处,其中实验组在材料侧槽中植入股骨的动静脉血管束,对照组则单纯植入组织工稗骨,分别于术后2、4、8、12周通过形态学检测新生骨量,免疫组织化学方法检测新生骨中VEGF的表达量.结果 随着时间进展,各组成骨量逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且从第4周开始实验组成骨量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);符时问点实验组新生骨中VEGF的表达最均高于对照组,差异有统汁学意义(P<0.05),且4周时达到最人值.结论 血管束植入组织工程骨可明显增加新生骨中VEGF的表达并能促进骨缺损的修复.     

不同浓度5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记山羊骨髓基质干细胞的体外研究

Objective To explore the feasibility of labeling and tracing in vitro goat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by bromodeoxyuridine (BrdU) on the basis of investigation of its optimal concentration, incubating time and cytotoxicity. Methods A healthy goat, aged 10 months old, male, weighing 32 kg, was used in this study. Bone marrow was aspirated. BMSCs were isolated and cultured using the adherence method in vitro. The fourth passage of BMSCs (P4) were incubated with BrdU at 5, 10, 15, 20 μmol/L as 5, 10, 15, 20 μmol/L BMSC groups. Cells were not labeled by BrdU as negative control. The following parameters were measured: induction, differentiation and determination of goat BMSCs; the optimal mass concentration and incubation time of 5-BrdU labeling; cell positive rate at 12, 24, 48 and 72 hours in each group using immunofluoreseenee; the cell survival rate after various concentrations of BrdU ladling by trypan-blue exclusion. Results The morphology of the primary and passage goat BMSCs was fusiform in shape. Goat BMSCs could differentiate into osteoblasts and chondrocytes following induction. BMSC nucleus showed green fluorescence under fluorescence microscope after being labeled by BrdU. The mean labeling rate increased with the increase in the concentration and incubation time of BrdU, and reached to (93.32± 3.25)% after incubation in 15 μmol/L, BrdU for 48 hours. There were no significant differences between 15 μmol/L BrdU for 72 hours, 20 μmol/L BrdU for 48 hours and 72 hours (P > 0.05), or between the other groups or time points (P < 0.05). The labeling rate of the blank control group was 0. The cell survival rate was all above 90% (P > 0.05). Conclusions BrdU can be used as a labeling marker for goat BMSCs. When the concentration is 15 μmol/L and the incubation time is 48 hours, the optimal labeling effect can be achieved. Goat BMSCs labeled with BrdU is of high efficiency and safety.     

不同浓度5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记山羊骨髓基质干细胞的体外研究

目的 利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记山羊骨髓基质干细胞(BMSCs),检测其最佳标记浓度、时间及细胞毒性,探讨作为山羊BMSCs标记及示踪方法的可行性.方法 抽取10个月龄健康中国青山千骨髓.贴壁培养并鉴定.以浓度分别为5、10、15和20 μmol/L的BrdU标记第4代细胞,分别记为A、B、C、D组;末用BrdU标记的细胞作为卒白对照组(E组).分别标记12、24、48和72 h后,免疫荧光法检测各组标记阳性率,锥虫蓝拒染法检测标记后细胞存活率.结果 原代及传代培养的山羊BMSCs态主要为梭彤,经诱导后能向成骨细胞和软骨细胞分化.标记后,荧光显微镜下胞核呈绿色荧光.随着标记时间和浓度的增加,各实验组标记阳性率逐渐增高,于15 μmol/L孵育48 h后,其标记率可达剑(93.32±3.25)%,与15 μmol/L孵育72 h和20 μmol/L孵育48,72 h筹异无统计学意义(P>0.05),与其他各绀各时间点筹异有统计学意义(P<0.05);各时间点空白对照组标记阳性率均为均为0.锥虫蓝拒染实验示各组细胞存活率均在90%以上,差异无统计学意义(P>0.05).结论 BrdU浓度为15μmol/L,标记时间为48 h时,对山羊BMSCs可得纠最佳的标记效果,且安全性较高.     

血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对局部血管内皮生长因了(VEGF)表达的影响.方法 将兔自体骨髓基质下细胞经诱导后与β-磷酸三钙材料复合,植入制备的兔股骨缺损处,其中实验组在材料侧槽中植入股骨的动静脉血管束,对照组则单纯植入组织工稗骨,分别于术后2、4、8、12周通过形态学检测新生骨量,免疫组织化学方法检测新生骨中VEGF的表达量.结果 随着时间进展,各组成骨量逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且从第4周开始实验组成骨量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);符时问点实验组新生骨中VEGF的表达最均高于对照组,差异有统汁学意义(P<0.05),且4周时达到最人值.结论 血管束植入组织工程骨可明显增加新生骨中VEGF的表达并能促进骨缺损的修复.     

新型多孔β-磷酸三钙作为骨组织工程支架材料的评价

背景: 新型多孔β-磷酸三钙是采用适当配方和独特工艺制成,其气孔率(75±10)%,球型孔>80%,微孔<20%,孔与孔的沟通率达100%,力学强度>2MPa.目的: 评价新型多孔β-磷酸三钙作为骨组织工程支架材料的应用效果.设计、时间及地点: 对比观察实验,于200-07/2006-03在南方医科大学组织工程实验室完成.材料: 6月龄新西兰大白兔12只,制备左侧桡骨1.5cm大段骨与骨膜缺损.多孔β-磷酸三钙为法国bio-lu公司产品.方法: 将兔骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞,与β-磷酸三钙复合培养,倒置相差显微镜和扫描电镜下观察细胞的生长情况,MTT法测定细胞增殖情况判断其细胞相容性.通过不同含量的β-磷酸三钙浸提液对细胞增殖的影响检验其细胞毒性.主要观察指标: 对β-磷酸三钙进行细胞相容性与细胞毒性检测.术后2,6,12周分别取材进行组织学检查,放射性核素骨扫描测定,X射线片检查,观察骨缺损部位的修复情况.结果: 新型多孔β-磷酸三钙细胞黏附性好,细胞毒性为0级.组织学、影像学和放射性核素骨扫描显示能够修复兔桡骨的大段骨缺损,且体内降解速率与骨的形成速率一致.结论: 新型多孔β-磷酸三钙是一种细胞相容性好的骨组织工程支架材料,修复兔桡骨大段骨缺损的效果良好.     

磁共振灌注成像监测组织工程骨血管化的研究

目的探讨磁共振灌注成像在组织工程骨血管化监测中的应用价值。方法成年恒河猴体内制备胫骨20mm的骨缺损，随机分为5组，A组：／β-磷酸三钙（β-TCP）＋骨髓基质干细胞（BMSCs）＋血管束；B组：β-TCP＋血管束；C组：β-TCP＋BMSCs；D组：β-TCP；E组：空白对照。术后4、8、12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间（SI—T）曲线的最大线性斜率（SSmax）和基线值（SIbascline），拍摄恒河猴胫骨x线片并计算其透光度。结果术后4、8、12周A组的SSk值最高，术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高（P〈0．01）。术后12周A组5个样本的SSmax与X线片透光度呈负相关（r=-1．0，P〈0．01）。结论SI-T曲线的SSmax能准确反映组织工程骨的血管化情况，磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复大段骨缺损

背景:神经肽作为存在于神经组织的一种内源性活性物质,作用于全身多个系统,调节体内各系统生理功能。目的:观察分别植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复兔大段骨缺损对降钙素基因相关肽、神经肽Y表达的影响。方法:新西兰兔共54只制备股骨大段骨缺损模型,以随机抽签法分为感觉神经束植入组、血管束植入组及对照组,每组各18只,分别给予单纯感觉神经束植入、单纯血管束植入及无血管神经束组织工程骨(对照组)修复治疗,分别于造模后4,8,12周对修复骨段行大体、Masson染色观察,比较修复骨段内降钙素基因相关肽和神经肽Y表达水平。结果与结论:(1)造模后4,8,12周,感觉神经束植入、血管束植入组降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05);(2)组织工程骨内降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平随时间增加先增高后下降,其中第8周降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平显著高于第4,12周(P<0.05);且第4周降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平显著低于其他时间点(P<0.05);(3)组织工程骨内降钙素基因相关肽主要表达于新生骨骨质边缘、骨膜及血管外周;神经肽Y主要表达于髓腔及血管外周;(4)结果说明,骨缺损中血管束或感觉神经束植入均可显著上调神经肽降钙素基因相关肽和神经肽Y合成水平,加快骨质修复进程;但感觉神经束植入组织工程骨可能引起支配区感觉功能丧失,故血管束植入更符合正常人体生理功能需求。     

人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响

目的构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体(RV),观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中,经酶切和测序鉴定,制备高滴度的RV,以流动感染法高效感染,半固体集落培养法测定基因导入率。用嘌呤霉素筛选后,获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照,用PCR鉴定基因的导入,并测定细胞周期及凋亡率等,研究plk3基因导入对细胞的影响。结果获得pMSCV-plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率,分别达82.3%±3.70%和62.9%±4.94%(n=3)。经嘌呤霉素筛选后,转基因细胞的阳性率>99%。K562-plk3-pu-roR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低(P<0.01);而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异。与K562细胞相比较,常规培养时,处于G0~G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[(49.7±3.38)%vs(43.9±2.34)%,P=0.03]。以无血清培养基培养10h后,进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[(43.6±3.74)%vs(54.5±1.52)%,P=0.02],凋亡率降低[(1.3±0.31)%vs(3.4±0.37)%,P=0.01]。结论构建了plk3基因的逆转录病毒载体,发现plk3基因的导入可延缓细胞增殖,并抑制细胞进入增殖周期。