血管束、感觉神经束植入组织工程骨修复大段骨缺损的成骨研究

目的 观察血管束、感觉神经柬植入组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损的成骨特点,探讨其对骨修复的影响. 方法 36只新西兰大白兔均制备左侧股骨干1.5 cm节段性骨缺损模型,随机分为三组(n=12),组织工程骨组(A组):自体骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙构建组织工程骨植入骨缺损;血管束植入组(B组):组织工程骨与血管束同时植入骨缺损;感觉神经束植入组(C组):组织工程骨与感觉神经束同时植入骨缺损.各组动物术后1、3、6个月行X线检查及影像学评分,同时每组各处死4只动物行大体及组织学观察.结果 影像学评分显示各时间点B组与C组的成骨优于A组,差异有统计学意义(P<0.05);B、C组间成骨差异无统计学意义(P>0.05).组织学观察显示新生骨多出现在血管周围,成骨方式以软骨内成骨为主. 结论血管束、感觉神经束植入组织工程骨的方法能更好地促进组织工程骨成骨及大段骨缺损修复.     

血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对局部血管内皮生长因了(VEGF)表达的影响.方法 将兔自体骨髓基质下细胞经诱导后与β-磷酸三钙材料复合,植入制备的兔股骨缺损处,其中实验组在材料侧槽中植入股骨的动静脉血管束,对照组则单纯植入组织工稗骨,分别于术后2、4、8、12周通过形态学检测新生骨量,免疫组织化学方法检测新生骨中VEGF的表达量.结果 随着时间进展,各组成骨量逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且从第4周开始实验组成骨量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);符时问点实验组新生骨中VEGF的表达最均高于对照组,差异有统汁学意义(P<0.05),且4周时达到最人值.结论 血管束植入组织工程骨可明显增加新生骨中VEGF的表达并能促进骨缺损的修复.     

组织工程骨神经化构建的组织学研究

[目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化,探讨组织工程骨神经化构建的效果.[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞,与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合制作组织工程骨,分别将不同类型神经束植入组织工程骨,进行以下分组:A组,组织工程骨组; B组,感觉神经束植入组; C组,运动神经束植入组; D组,血管束(含有自主神经)植入组; E组,感觉、运动神经束联合植入组.分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)的免疫组织化学检测,并进行统计学分析,以比较骨缺损修复情况.[结果]在观察期内,有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用,而运动神经束植入却没有明显的促进作用.[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用,可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法.     

恒河猴体内组织工程骨血管化的监测

目的:采用X线、放射性核素骨显像、磁共振灌注成像三种不同方法监测组织工程骨血管化的情况,对比分析各种方法的优缺点。方法:实验于2005-05/08在南方医科大学南方医院动物实验中心完成。①选用13只成年雄性恒河猴的26条下肢,取1条下肢用于骨髓基质干细胞的培养,其余25条下肢分为5组:β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组、β-磷酸三钙 血管束组、β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞组、单纯β-磷酸三钙组、空白对照组,5条/组。β-磷酸三钙直径12mm,长度20mm,横截面呈C型。血管束来源于恒河猴胫骨内侧皮下隐动脉分支,其外径约0.8～1.0mm。②13只恒河猴麻醉后,取胫前直切口,沿胫前肌与胫骨间隙进入。于胫骨外侧放置7孔AO重建钛钢板,除第4孔外其余孔2.5mm钻头钻孔,3.5mm丝攻攻丝后钛螺钉固定。于钢板第3～5孔之间用线锯锯断胫骨,切除该段相应骨膜,造成2cm的段缺性骨与骨膜缺损。然后根据动物分组填入各自相应材料,制备动物模型。③各组术后4,8,12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间曲线的最大线性斜率(SSmax)及基线值(SIbaseline),拍摄恒河猴胫骨X线片并计算其透光度,同时行放射性核素骨显像检查并计算摄取比值。结果:实验选用13只成年雄性恒河猴的25条下肢,全部进入结果分析。①各组术后骨缺损区X线检查结果:各组骨缺损区透光度随着术后周数的延长均呈现不同的下降趋势。与术后4周比较,术后8,12周β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组均明显下降(P=0.001);与术后8周比较,术后12周β-磷酸三钙 血管束组、β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞组均明显下降(P=0.002,P=0.021)。②各组术后骨缺损区放射性核素骨显像结果:β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组、β-磷酸三钙 血管束组、β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞组、单纯β-磷酸三钙组感兴趣区同位素计数比值均为术后8周最高,术后12周最低。③各组术后骨缺损区磁共振灌注成像情况:术后4,8,12周β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组的SSmax值最高,且术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高(P=0.003)。术后12周β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组5个样本的SSmax与同期X线透光度呈负相关(r=-1.0,P=0.000)。结论:信号强度-时间曲线的SSmax能够准确反映组织工程骨的血管化情况,磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

骨性材料复合绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞研究体系的建立与应用

背景：由于骨性生物材料和骨组织本身坚硬致密的物理特性,限制了对生长在其中的靶细胞的示踪研究。目的：针对骨性材料含钙、透光性差的特性,拟建立骨性材料复合绿色荧光蛋白基因标记的骨髓间充质干细胞的研究体系。设计、时间及地点：体外观察实验,于2008-06/2009-01在南方医科大学南方医院骨与软骨再生医学重点实验室完成。材料：β-磷酸三钙多孔骨性生物支架材料（1cm&#215;1cm&#215;0.8cm）购自上海贝奥路生物材料有限公司。3月龄新西兰大白兔用于获取并培养骨髓间充质干细胞。方法：①骨髓间充质干细胞以携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记后,接种于β-磷酸三钙骨性生物支架材料内部。②以荧光倒置显微镜观测材料中细胞的生长情况,并通过荧光定量聚合酶链反应等检测材料内部细胞的增殖情况。③以自创的半固体脱钙体系对复合细胞的材料脱钙后,制备连续冰冻切片观察;同时,采用不脱钙塑料包埋、扫描电镜等方法观察。主要观察指标：骨性材料中绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的分布、形态及增殖情况。结果：①荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞在材料内部生长、增殖。②普通聚合酶链反应可对材料内的绿色荧光细胞进行定性分析,荧光定量聚合酶链反应检测的Ct值和接种的绿色荧光细胞数量呈指数相关,故可以对材料中的绿色荧光细胞进行定量分析。③半固体脱钙可使骨性材料内部坚硬的钙质成分消失,而细胞所在的位置、形态和荧光不变;不脱钙塑料包埋可以原位保留细胞形态和荧光,但仅适用于小块组织;而扫描电镜观察范围有限,细胞无法保留荧光。结论：建立了可在骨性材料内部方便、直观地追踪绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的体系,具有广泛的应用前景。     

骨性材料复合绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞研究体系的建立与应用术

背景:由于骨性生物材料和骨组织本身坚硬致密的物理特性,限制了对生长在其中的靶细胞的示踪研究.目的:针对骨性材料含钙、透光性差的特性,拟建立骨性材料复合绿色荧光蛋白基因标记的骨髓问充质干细胞的研究体系.设计、时间及地点:体外观察实验,于2008-06/2009-01在南方医科大学南方医院骨与软骨再生医学重点实验室完成.材料:β磷酸三钙多孔骨性生物支架材料(1 cm×1 cmx0.8cm)购自上海贝奥路生物材料有限公司.3月龄新西兰大白兔用于获取并培养骨髓间充质干细胞.方法:①骨髓间充质干细胞以携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记后,接种于β-磷酸三钙骨性生物支架材料内部.②以荧光倒置显微镜观测材料中细胞的生长情况,并通过荧光定量聚合酶链反应等检测材料内部细胞的增殖情况.③以自创的半固体脱钙体系对复合细胞的材料脱钙后.制备连续冰冻切片观察;同时,采用不脱钙塑料包埋、扫描电镜等方法观察.主要观察指标:骨性材料中绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的分布、形态及增殖情况.结果:①荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞在材料内部生长、增殖.②普通聚合酶链反应可对材料内的绿色荧光细胞进行定性分析,荧光定量聚台酶链反应检测的Ct值和接种的绿色荧光细胞数量呈指数相关,故可以对材料中的绿色荧光细胞进行定量分析.③半固体脱钙可使骨性材料内部坚硬的钙质成分消失,而细胞所在的位置,形态和荧光不变;不脱钙塑料包埋可以原位保留细胞形态和荧光,但仅适用于小块组织;而扫描电镜观察范围有限,细胞无法保留荧光.结论:建立了可在骨性材料内部疗便、直观地追踪绿色荧光蛋白标记骨髓闻充质干细胞的体系,具有广泛的应用前景.     

YCD基因修饰对小鼠P388白血病的体内治疗作用研究

目的：以P388/DBA小鼠白血病模型,探讨新型自杀基因YCD的体内治疗作用。方法：用逆转录病毒载体将YCD基因导入,筛选P388YCDeGFP细胞克隆,以P388eGFP和野生性（wt）P388细胞为对照。（1）3组细胞腹腔接种给DBA小鼠（n=5）,5×106/只（下同）,观察致病性;（2）3组细胞腹腔接种给DBA小鼠（n=5）,分别以5FC治疗2周,观察疗效;（3）2组×5只小鼠腹腔接种P388YCDeGFP,5FC 5 μmol/L·d-1×2 d或PBS治疗,根据小鼠存活时间推算杀伤效率。以流式细胞仪、冰冻切片和HE切片检测各脏器中白血病细胞的分布和变化。结果：基因导入对细胞的生物学特性影响不显著;5FC治疗2周,YCD组小鼠存活(17.8±1.89) d,而eGFP组和wtP388组分别存活(7.8±1.10) d 和(7.7±1.15) d （P<005）;5FC治疗2 d的杀伤率达99.6%。结论：YCD转基因细胞在体内可被5FC有效杀灭,该系统具有应用前景。     

磁共振灌注成像监测组织工程骨血管化的研究

目的探讨磁共振灌注成像在组织工程骨血管化监测中的应用价值。方法成年恒河猴体内制备胫骨20mm的骨缺损，随机分为5组，A组：／β-磷酸三钙（β-TCP）＋骨髓基质干细胞（BMSCs）＋血管束；B组：β-TCP＋血管束；C组：β-TCP＋BMSCs；D组：β-TCP；E组：空白对照。术后4、8、12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间（SI—T）曲线的最大线性斜率（SSmax）和基线值（SIbascline），拍摄恒河猴胫骨x线片并计算其透光度。结果术后4、8、12周A组的SSk值最高，术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高（P〈0．01）。术后12周A组5个样本的SSmax与X线片透光度呈负相关（r=-1．0，P〈0．01）。结论SI-T曲线的SSmax能准确反映组织工程骨的血管化情况，磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

bcr-abl P210和abl基因实时荧光定量PCR检测共用质粒标准品的制备及应用

 目的 建立一个荧光实时定量PCR（RQ-PCR）共用质粒标准品,用于同时检测bcr-abl P210白血病融合基因和abl内参基因。方法 分离K562细胞RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收,T-A载体克隆后,转化JM109工程菌,抽提质粒、测序、测定拷贝／μl,冻存备用。以RQ-PCR和定性巢式PCR进行验证,检测23例CML患者的骨髓标本,并同bcr-abl基因荧光原位杂交（FISH）结果比较。结果 获得了预期的模板质粒,以欧洲抗癌协会推荐的引物探针RQ-PCR检测bcr-abl P210和abl基因,浓度相同时,Ct值相同;反复检测日内差和日间差均<5 %。23例标本按FISH结果≥10%（n=8）、0.5 %～10 %（n=6）和阴性（n=9）分组,RQ-PCR结果分为0.492±0.263、0.023±0.033和（4.33±3.84）×10-4;FISH阴性组和其余两组间P值均＜0.001,三组间P值均＜0.05。结论 该研究建立了bcr-abl P210基因和abl基因共用的质粒标准品,定量准确,性质稳定,能简化操作,满足临床检测和科研的要求。     

人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响

目的构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体(RV),观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中,经酶切和测序鉴定,制备高滴度的RV,以流动感染法高效感染,半固体集落培养法测定基因导入率。用嘌呤霉素筛选后,获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照,用PCR鉴定基因的导入,并测定细胞周期及凋亡率等,研究plk3基因导入对细胞的影响。结果获得pMSCV-plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率,分别达82.3%±3.70%和62.9%±4.94%(n=3)。经嘌呤霉素筛选后,转基因细胞的阳性率>99%。K562-plk3-pu-roR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低(P<0.01);而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异。与K562细胞相比较,常规培养时,处于G0~G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[(49.7±3.38)%vs(43.9±2.34)%,P=0.03]。以无血清培养基培养10h后,进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[(43.6±3.74)%vs(54.5±1.52)%,P=0.02],凋亡率降低[(1.3±0.31)%vs(3.4±0.37)%,P=0.01]。结论构建了plk3基因的逆转录病毒载体,发现plk3基因的导入可延缓细胞增殖,并抑制细胞进入增殖周期。