EHEC O157与宿主细胞作用的效应分子和易位分子研究进展

EHEC O157是一种重要的人兽共患病病原菌,人感染后可引发急性腹泻、出血性肠炎（HC）,溶血性尿毒综合征（HUS）及血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。重度感染可致死,死亡率达10％。     

有氧胁迫幽门螺杆菌球形变异的实验研究

目的 对有氧胁迫下幽门螺杆菌（Hp）的球形变异特征进行研究。方法 采用细菌学、酶学、遗传学、动物实验等方法对有氧胁迫作用下形成的Hp球形体进行实验研究。结果 随着有氧胁迫时间的延长,Hp螺旋体逐渐转化为球形体,代谢及酶活性逐渐下降并趋于稳定,与Hp定居相关的毒力基因表达有所减弱,但SodB和Kat在基因表达和酶活检测中均保持较高水平;部分Hp球形体可在小鼠体内回复定植。结论 有氧胁迫下形成的Hp球形体代谢活性及毒力均有所减弱,但部分球形体仍具有活性。SodB和Kat可能在Hp活性氧代谢中发挥着重要作用。     

重庆地区汉族人群HLA-DRB1等位基因多态性研究

目的了解中国重庆地区汉族人群人类白细胞抗原HLA-DRB1基因多态性及其分布特点。方法应用自行建立的聚合酶链式反应-测序为基础的分型方法(PCR-SBT)对190例重庆地区汉族人群进行HLA-DRB1基因分型和多态性分析。结果共检测出13种HLA-DRB1等位基因,20种等位基因型。其中,HLA-DRB1*09:01(29.1%)等位基因频率最高,其次为HLA-DRB1*04:05(12.2%)、HLA-DRB1*08:03(9.3%),基因频率最低的是HLA-DRB1*12:01、HLA-DRB1*12:02、HLA-DRB1*14:05和HLA-DRB1*15:02,各占1.26%。此外,检出的20种HLA-DRB1等位基因型在男女性别间无显著差异。结论成功建立并优化了HLA-DRB1的PCR-SBT基因分型方法;重庆地区汉族人群HLA-DRB1等位基因呈现多态性,为群体遗传和疾病关联的研究提供了可靠的遗传学数据。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 TCCP蛋白与宿主细胞IRTKS蛋白的相互作用

目的通过体外结合实验验证EHEC O157:H7内膜素受体偶联细胞骨架蛋白重复片段与人肠上皮细胞IRTKS蛋白SH3结构域之间的相互作用,并制备二者蛋白复合体,为利用晶体学方法研究其相互作用奠定基础。方法将IRTKS蛋白的SH3结构域cDNA序列克隆至pET30a表达质粒,转化BL21(DE3),诱导表达纯化SH3(IRTKS)蛋白;制备TCCP重复片段TC-CP(3R)蛋白;将SH3(IRTKS)与TCCP(3R)按照不同比例混合后,非变性丙烯酰胺凝胶电泳鉴定两者相互结合后产物;利用分子筛层析收集标准蛋白、TCCP(3R)、SH3(IRTKS)和TCCP(3R)-SH3(IRTKS)复合体的出峰体积,回归计算复合物的分子量,分析蛋白相互结合的比例。结果成功克隆表达了SH3(IRTKS)重组质粒;并制备了高纯度的SH3(IRTKS)和TCCP(3R)蛋白;非变性丙烯酰胺凝胶电泳结果证实TCCP(3R)与SH3(IRTKS)发生相互作用形成了蛋白质复合体;复合体的分子量约为33 000,二者相互结合的比例约为1:1。结论本研究为TCCP重复片段与SH3(IRTKS)相互作用提供了直接证据,同时复合体的制备,为利用晶体学研究两者的相互作用奠定了基础。     

生物技术制药创新型实验教学平台的探索与实践

生物技术是生命科学和工程技术相互渗透、融合产生的一门新技术,是21世纪以来发展最为迅猛的高新技术之一,越来越广泛地应用于医药、农业、轻工、食品等诸多领域,对提升传统产业技术水平和可持续发展能力具有重要影响。随着生物技术的飞速发展。生物医药已成为全球最活跃、进展最快的产业之一。发展生物医药产业具有高效益、高增长、低污染、低耗能的好处,有很强的技术复合性和产业关联性。     

生物技术制药实验教学模式的探索

生物技术制药是一门实践性和综合性很强的学科,是当前研究最热、发展迅速的学科之一。随着科学技术的迅猛发展．生物制药已成为最活跃、发展最快的产业之一。制药业对生物技术制药人才的需求也日益增加．针对这些情况．如何增强生物技术制药实验课的教学效果,培养高素质的具有创新精神和实践能力的生物技术制药人才,是当前培养生物技术专业人才所需要重点关注的问题之一。生物技术制药课程着重讨论应用基因工程、发酵工程、酶工程、细胞工程、抗体工程、蛋白质工程等现代生物技术的原理和方法研制生物制品,是“现代生物技术”与“制药”的有机结合。因此,本课程涉及的知识面广,内容多,不仅包括与生物技术相关的一些基本理论．还包括与制剂、质量控制等生物制药相关药学知识。     

miR-222在胃癌中的表达分析及其靶基因FOS的鉴定

目的分析miR-222在胃癌中的表达水平并鉴定miR-222的靶基因。方法选取第三军医大学新桥医院普外科10例患者的胃癌及远癌组织,匀浆法提取总RNA,用Real-time PCR法检测miR-222表达。利用miRNA靶基因预测数据库TargetScan,MICROCOSM及PicTar对miR-222的靶基因进行预测。化学合成包含有miR-222结合位点的靶基因3′非编码区(3′UTR)退火引物,插入荧光素酶报告载体pMIR-REPORT及绿色荧光蛋白(GFP)报告载体pMIR-GFP-RE-PORT,检测荧光素酶的活性变化及观察GFP表达量,并在蛋白水平用Western blot检测miR-222对靶基因的抑制。结果 miR-222在70%(7/10)的胃癌组织样本中表达上调。生物信息学(TargetScan,MICROCOSM及PicTar 3个miRNA靶基因预测数据库)分析可得在包括人类在内的不同物种中,FOS基因3′UTR区都有miR-222的保守结合种子序列。通过荧光素酶活性检测和GFP抑制试验可得miR-222在mRNA水平可以与FOS基因结合。Western blot结果显示miR-222...     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA-Stx2B融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究

目的 重组表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA与Stx2B融合蛋白,并对其生物学活性进行初步研究.方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因及stx2B基因,两基因通过连接子(linker)相连,T/A法克隆,克隆至pET-28a(+)表达载体上,转化宿主细胞E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,免疫印迹分析免疫反应性.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性,然后对免疫小鼠进行O157活菌攻毒试验和O157超声上清致死保护试验.结果 构建的espA-stx2B融合基因片段的测序结果 与理论预测值完全一致.融合蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约40%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与EspA和Stx2B抗体发生抗原抗体反应.免疫小鼠其特异性抗体阳转率达100%,EspA和Stx2B抗体的几何平均滴度(GMT)分别增长了124.30倍和58.49倍.免疫小鼠O157活菌攻毒保护试验免疫后排菌时间和排菌量与对照组相比并没有明显改变,O157菌超声上清致死保护试验免疫组存活率为10/15,对照组全部死亡.结论 在E. coli中高效表达了EspA-Stx2B融合蛋白,此融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白免疫小鼠并不能降低细菌在小鼠胃肠道的黏附与定植,但却起到明显的免疫保护作用,保护率为66.7%(10/15).