应用Hoefer GE 200 Gel Eluter纯化重组的LTB

目的：纯化基因重组表达的大肠杆菌毒素B亚单位（LTB），方法：采用Hoefer GE 200 Gel Eluter从聚丙烯酰胺凝胶中回收LTB蛋白，SDS－PAGE，HPLC分析其纯度，western-blot分析其免疫学性质，结果：电洗脱1次可获得300ug重组蛋白，纯化蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳表现为单一蛋白质带，HPLC检测纯度为99．46％，免疫印迹证实其保持有免疫学活性。结论；该系统纯化LTB蛋白操作方便，快捷，所得蛋白纯度好，回收率高。     

生物技术制药科研式实验教学的实践与体会

生物技术制药是当今世界科学发展中极为重要、极为活跃的领域。随着该产业的迅猛发展,对生物技术制药人才的需求也日益增加。鉴于此,第三军医大学从2007年开始在药学和生物技术本科专业开设了《生物技术制药》这门课程。该课程是一门新兴的交叉学科,目前国内开设本课程的院校较少,可借鉴的经验不多。教学实践过程中,本校通过充分利用国家免疫生物制品工程技术研究中心的平台优势,在该课程的实验教学中推广科研式的教学模式,取得了良好的效果,现将如何提高该课程实验教学质量的措施和体会总结如下。     

类鼻疽杆菌基因组学概述及进展*

摘要：类鼻疽伯克霍尔德杆菌是一种人体机会致病菌,导致的疾病称类鼻疽,是一种典型的热带疾病,能感染机体几乎任何器官。类鼻疽杆菌分布广泛,主要存在于水及土壤中,其耐受性极强,能在土壤中存活几十年之久,被美国CDC列为B类生物恐怖剂。随着病原菌的扩散和人类活动的影响,全球范围内关于类鼻疽病例报道的增加,越来越多的证据表明类鼻疽是一种正在扩散的人兽共患病。海南、广东等地正是类鼻疽感染的重灾区,而国内类鼻疽杆菌的研究还很少,也没有类鼻疽杆菌研究的标准株和基因组学理论基础,获取国际标准菌株资源受到西方国家的限制,鉴于类鼻疽杆菌的特殊性、类鼻疽严峻的流行形势及科研壁垒,加强类鼻疽的研究有着重要的社会意义和军事价值。本文总结了类鼻疽杆菌（K96243标准株）的全基因组的特点,结合了当今的DNA测序的发展现状,指出开展国内类鼻疽杆菌全基因测序的必要性和紧迫性。     

幽门螺杆菌微球疫苗非临床实验初步研究*

目的：通过考察幽门螺杆菌（Helicobacter pyliori，np）微球生物学行为，探讨其作为口服蛋白疫苗的可行性。方法：用可降解天然高分子材料一壳聚糖和海藻酸钠制备Hp全菌蛋白微球（HpWCP—CAMS），通过BCA方法测定微球中蛋白质的包裹效率及包裹量，测定微球在体外的药物释放度。并进行小鼠体内微球的靶向试验，微球的体内外毒性试验和淋巴细胞致敏试验。结果：HpWCP—CAMS中蛋白包裹量为31．5％，蛋白包裹效率为61．O％。微球中药物缓释周期可长达20d，靶向试验结果显示微球能在肠黏膜、PP结及脾脏富集并能有效诱导淋巴细胞致敏。体外毒性显示125μL微球（5mg-mL^-1）对Hela细胞生长无明显影响，体内实验结果显示其对小鼠生长也没有影响。结论：HpWCP—CAMS具有良好的靶向性和缓释特征，无细胞毒性，有望作为疫苗进一步研究。     

幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性.方法 PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果 PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的 基因.重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论 成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。     

EHEC O157与宿主细胞作用的效应分子和易位分子研究进展

EHEC O157是一种重要的人兽共患病病原菌,人感染后可引发急性腹泻、出血性肠炎（HC）,溶血性尿毒综合征（HUS）及血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。重度感染可致死,死亡率达10％。     

有氧胁迫幽门螺杆菌球形变异的实验研究

目的 对有氧胁迫下幽门螺杆菌（Hp）的球形变异特征进行研究。方法 采用细菌学、酶学、遗传学、动物实验等方法对有氧胁迫作用下形成的Hp球形体进行实验研究。结果 随着有氧胁迫时间的延长,Hp螺旋体逐渐转化为球形体,代谢及酶活性逐渐下降并趋于稳定,与Hp定居相关的毒力基因表达有所减弱,但SodB和Kat在基因表达和酶活检测中均保持较高水平;部分Hp球形体可在小鼠体内回复定植。结论 有氧胁迫下形成的Hp球形体代谢活性及毒力均有所减弱,但部分球形体仍具有活性。SodB和Kat可能在Hp活性氧代谢中发挥着重要作用。     

鼻疽和类鼻疽疫苗研究进展

鼻疽杆菌和类鼻疽杆菌属假单胞菌属,所致疾病分别为鼻疽和类鼻疽,主要流行于澳大利亚北部、泰国和新加坡,中国、北美等其他国家和地区也有散发病例报道。易获取、易播散、治疗困难和缺乏疫苗使得这类细菌有可能被用作生物武器,美国国立卫生研究院（NIH）和美国疾病控制预防中心（CDC）将这两类细菌列为B类病原体。当前各国正在积极开发疫苗,但由于这两种病原体的特殊性致使疫苗研究困难重重,脂多糖抗体被证实有一定保护作用,但是菌毛、外膜蛋白及Ⅲ型分泌系统因子相关的疫苗的保护性并不令人满意。此文主要阐述这两类细菌疫苗的研究进展。