致泻性大肠杆菌疫苗研究进展

大肠杆菌引起的腹泻多发生在儿童及发展中国家,发展致泻性大肠杆菌疫苗具有特殊的意义。除了灭活疫苗、减毒疫苗、结合多糖疫苗和亚单位疫苗外,新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗和ghost疫苗技术为疫苗的研制提供了新的思路。本文综述了目前致泻性大肠杆菌疫苗研究的新进展。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

中国类鼻疽菌的耐药谱调查及耐药机制分析

类鼻疽是一种由类鼻疽伯克霍尔德菌导致的热带医学疾病,其临床表现多样,也有“似百样病”之称,其病原已被美国CDC列为生物恐怖剂.类鼻疽在中国的海南、广西以及福建等地都有过报道,但由于其误诊率高,也未被列为法定报告的传染病,对类鼻疽的研究并未得以重视.类鼻疽菌对多种抗生素具有天然的耐药性,同时其基因组变异迅速,能产生新的耐药特性,造成的感染极易复发,治疗困难.目前临床上对类鼻疽的耐药检测还未建立统一的检测指标和判断标准,国内也还没有规范的类鼻疽抗生素用药指南.我们总结了中国2006-2014年公开发表文献中的类鼻疽临床用药及耐药结果,结合本室的类鼻疽临床资源库数据,对中国类鼻疽菌的耐药谱进行统计分析,总结用药规律,以期寻找合适的用药方案;同时,还分析了类鼻疽菌的可能耐药机制,探讨了类鼻疽耐药的深层次原因,以期为后续类鼻疽的治疗及用药指南的制定提供理论指导和临床借鉴参考.     

抗类鼻疽伯克霍尔德菌多抗血清的制备及评价

目的制备抗类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudoamllei,其抗原简写为BP)多抗血清,评价不同处理方式对抗原免疫原性的影响.方法 采用超声破碎、甲醛灭活、热灭活3种方式处理细菌抗原接种新西兰兔和BALB/C小鼠,检测不同抗原免疫动物抗血清的ELISA效价及凝集试验效价.结果 (1)ELISA方案最佳条件:二抗稀释度为1/8 000,抗原包被浓度为4 μg/mL或8 μg/mL;凝集反应最佳条件:细菌浓度为6×109 CFU/mL、凝集温度为37 ℃、观察时刻为4 h.(2)超声破碎抗原(U-BP)免疫新西兰兔和小鼠的抗血清ELISA效价高达1/64 000,最高血清凝集效价分别为1/32和1/64,甲醛灭活抗原(F-BP)抗血清ELISA效价高达1/16 000,凝集效价为1/128和1/64;热灭活抗原(H-BP)抗血清ELISA效价达1/8 000,凝集效价为1/16和1/64.(3)F-BP和H-BP具有较强的免疫原性,U-BP在小鼠中的免疫原性较弱(P<0.05).结论 建立了抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多克隆抗体的检测方法,制备了高效价的抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多抗血清;甲醛灭活和热灭活细菌具有较好的免疫原性,为下一步类鼻疽伯克霍尔德杆菌的致病机制研究和疫苗研发打下了基础.     

横跨医学检验专业主干课程的“三性”实验课设计与初步实践

医学检验专业主要包括临床微生物学与微生物检验、临床免疫学与免疫检验、临床生物化学与检验等主干课程,但长期以来各课程均独立开展实验课教学,存在部分实验内容重复,各学科间有机结合不够,学生对医学检验专业理论知识掌握和实验技能培训不连贯等问题。本文对检验医学各主干课程的实验课内容进行深入调研,寻找出彼此间重叠的实验内容与项目,重新整合设计出横跨医学检验专业主干课程的“三性”实验项目,并进行初步的教学实践与分析,为医学检验专业实验课的教学改革奠定了工作基础。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质研究

目的 分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质。方法 重组尿素酶B亚单位注射免疫BALB／c小鼠、家兔，双向琼脂扩散、ELISA、免疫印迹分析特异抗体的产生及性质。结果 重组尿素酶B亚单位能有效刺激机体的免疫应答，且产生的抗体能与天然幽门螺杆菌发生抗原抗体反应。结论 重组尿素酶B亚单位表现出天然幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质，提示可作为幽门螺杆菌特异性抗体检测的包被抗原及幽门螺杆菌疫苗的有效成分。     

类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅲ型分泌系统蛋白BsaL的制备和免疫反应性分析

目的 构建表达重组的类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅲ型分泌系统结构蛋白BsaL的大肠工程菌,制备高纯度、高质量的重组BsaL蛋白样品,探讨其作为类鼻疽菌检测的候选抗原的可行性.方法 基因工程技术构建表达重组BsaL蛋白的大肠工程菌,通过亲和层析、凝胶过滤层析等纯化方法得到高纯度的BsaL蛋白.包被BsaL蛋白于96孔板,分析其用于检测临床类鼻疽菌株的敏感性和特异性.结果 成功构建了表达重组BsaL蛋白的大肠工程菌,诱导、表达及纯化后得到高纯度(＞99％)、高浓度(20 mg/mL)的重组BsaL蛋白.该蛋白在类鼻疽菌检测方面表现出较好的灵敏度(85％)和特异性(89％).结论 成功表达了重组的BsaL蛋白,获得了高纯度的BsaL蛋白样品,在类鼻疽菌的诊断方面展示出较好的应用价值.     

类鼻疽伯克霍尔德菌BPSL1549基因敲除株的构建及鉴定

目的 构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株[BP(△BPSL1549)],建立有效的类鼻疽菌毒力基因敲除平台.方法 设计引物扩增类鼻疽菌BPSL1549基因上下游同源臂,连接至pK18 mobSacB自杀质粒上,通过大肠杆菌S17-1 λpir以接合方式将其转入类鼻疽菌中.利用同源重组原理替换野生株中的BPSL1549基因,经过蔗糖筛选靶标基因敲除株,并采用PCR、Western blot检测方法鉴定敲除株,利用动物模型评价敲除株表型变化.结果 BP(△BPSL1549)菌株与野生株的BPSL1549基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少600 bp,Western blot检测敲除株不表达BPSL1549基因编码蛋白,成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株.动物实验证实敲除株相比野生株毒力显著降低(P＜0.05).结论 利用同源重组原理成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株,完善了类鼻疽菌敲除平台和评价体系.     

利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6

目的 构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中.方法 利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPEC J96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pIsQ,转化E. coliTop10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达.结果 获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/E. coli Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带.结论 大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗免疫小鼠的实验研究

目的 研究肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力.方法 将60只BALB/c小鼠平均分为5组,分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PBS对照组,用注射方式免疫3次,抗原和佐剂均为每次100μg/只.采集免疫前和各次免疫后7d的小鼠血清检测抗体,末次免疫10d后以109CFU的0157全菌液经口感染小鼠.观察小鼠临床症状及死亡情况,检测粪便与肠道带菌情况,并作病理组织学检测.结果 各抗原免疫组小鼠特异抗体明显增加,感染后各组小鼠均有死亡,IntiminC300、Stx2B、HlyAN436和联合免疫组保护率分别为73%、64%、36%和91%.未病死小鼠粪便排菌情况:对照组22d,实验组为5～14d.肠道带菌情况:对照组阳性率为100%,实验组为25%～83%.病死小鼠肺脏、肝脏均有明显组织病理学改变.结论 Intim-inC300、Stx2B和HlyAN436疫苗对于O157感染具有一定的预防作用,而联合免疫效果又大于单独免疫.