大肠杆菌LTB与幽门螺杆菌HSPA融合表达载体的构建与表达

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的包涵体形式融合表达载体。方法 PCR扩增LtB基因,并在其5' 端去掉信号肽,3'端去掉终止子,引入编码YPQD接头,通过PstI BamHI酶切位点重组于PinPoint^TM Xa- Ⅲ载体上,转化E.coli JM109,SDS－PAGE及Western-blot分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒,并将幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与之融合获得了表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内粘膜佐剂特性奠定了基础。     

单纯疱疹病毒型特异性的鉴别诊断

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)分为HSV-1、HSV-2两个型别。两型的DNA有50%的同源性。目前血清学检测无法区分HSV型别。有效地鉴别HSV两型对疾病的诊断治疗和患者的身心健康至关重要。现对Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的鉴别诊断方法作一综述。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7外膜蛋白A敲除菌株的构建及其黏附作用研究

目的利用Red同源重组技术构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7外膜蛋白A(ompA)基因敲除菌株,研究敲除菌株的黏附能力变化,阐明OmpA在细菌黏附以及致病中的作用。方法利用Red同源重组技术对EHEC O157∶H7 ompA基因进行敲除,同时构建EHEC O157:H7 ompA回复突变菌株,最后通过细胞试验对EHEC O157∶H7野生型菌株、敲除菌株及回复突变菌株的黏附能力进行比较。结果成功构建了EHEC O157:H7 ompA基因敲除菌株及其回复突变菌株。细胞试验结果表明,与野生型菌株相比,敲除菌株的黏附能力明显下降,而将ompA基因进行回复突变后其黏附能力又得到回复。结论 OmpA在EHEC O157∶H7黏附HeLa细胞过程中发挥重要作用,ompA基因敲除菌株的获得为进一步研究其功能提供了帮助。     

重组卡介苗的研究进展

卡介苗（BCG）不仅是目前预防结核病的有效疫苗，而且随着人们对其生物遗传学性质的深入研究证实，许多外源基因都可在BCG中获得表达且具有较好的免疫效果。利用BCG表达外源基因制备重组卡介苗在预防及治疗疾病方面具有潜在的应用前景。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的 采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株。方法 PCR扩增幽门螺直菌尿素酶B亚单位,与pYA3149(asd^ ）载体质粒重组,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株,SDS-PAGE,用western-bolt分析其表达,并观察重组菌体外传代培养的稳定性。结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代。结论 表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒伤寒沙门氏菌工程菌株的成功构建为发展幽门螺杆菌的口服基因工程疫苗奠定了基础。     

免疫学方法治疗烟草依赖的现状

动物实验显示,疫苗和尼古丁特异性抗体可以显著减轻尼古丁的行为效应,而后者与烟草依赖密切相关,这为免疫学方法治疗烟草依赖提供了依据.迄今为止,尼古丁疫苗的Ⅰ期临床试验结果证实,疫苗可以诱生相应的抗体,抗体水平呈剂量依赖性升高,而且不会引起严重的不良反应.这表明免疫学方法治疗烟草依赖有着很大的前景.本文主要就以上研究内容和相关进展进行简要综述.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300)。方法采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300,T-A克隆后依次构建至表达载体pET-28a(+),转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),测序鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC O157∶H7基因组中分别扩增出了约580bp(espA)和900bp(eaeC300)的目的片段,将二者融合构建了重组质粒pET-28a(+)-espA-eaeC300,测序结果与理论预测值一致性为99.9%(1501/1502)。融合蛋白在工程菌中表达量约40%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量(Mr)约54×103Da,破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体洗涤后纯化,获得目的蛋白纯度约90%。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白(EspA-IntiminC300),此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,为研制EHECO157∶H7多亚单疫苗奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组扩增TccP基因,构建TccP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗TccP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Western blotting法进行测定和分析。结果从EHEC O157∶H7 Sakai菌株中克隆出了1014bp的TccP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达;以TccP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,Western blotting分析此抗体能与TccP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TccP基因,所获TccP具有良好的抗原性,为进一步研究TccP在EHEC O157∶H7致病机制中的作用奠定基础。