肠出血性大肠杆菌0157:H7 LexA蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 对EHEC 0157:H7 lexA达、纯化,并检测其免疫活性.方法 lexA基因片段插入表达载体pET22b( ),在E..coli BL21(DE3)中表达.包涵体经洗涤并用8 mol/L尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第-步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定LexA蛋白的浓度,将纯化的kxA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗lexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western blot分析LexA的免疫活性.结果 lexA以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经Heparin Agrose亲合柱层析和凝胶过滤层析两步组合纯化目的 蛋白,经HPLC测定目的 蛋白的最终纯度为98%,表达及纯化的lexA具有良好的免疫活性.结论 在E.coli BL21(DE3)中表达的LexA蛋白具有良好的免疫活性.     

抗幽门螺旋杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体抗原识别表位的初步鉴定

目的 初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体(mAb)6E6识别的抗原表位.方法 采用截短法分段构建含UreB抗原的重组质粒,分别命名为U12,U13,U15,U16,U47.用IPTG诱导表达融合蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot 分析.结果 6E6能够分别识别1～300位氨基酸的U12片段,1～260位氨基酸的U16片段,1～230位氨基酸的U15片段,而不能识别1～200位氨基酸的U13片段和251～389位氨基酸的U47片段.结论 mAb 6E6抗体识别的抗原表位位于200～230位氨基酸.     

医学检验本科生科研能力训练与创新素质的培养

正培养具有较强科研能力的医学人才是培养高素质创新人才和发展研究型医科大学教育事业的关键。本文针对本校五年制医学检验专业本科生的教育特点,探讨通过教学实践将大学本科生科研能力训练和创新能力培养贯穿于理论及实验教学中,通过鼓励学生参与各类创新性实验活动,完善本科生导     

具核梭杆菌诱导的肠上皮细胞Caco-2炎症反应及凋亡

目的研究具核梭杆菌诱导人肠上皮细胞(Caco-2)的炎症反应与凋亡,并初步探讨其机制。方法具核梭杆菌感染Caco-2细胞后,采用RT-PCR及ELISA检测促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的转录水平和蛋白水平的表达,利用透射电镜、流式细胞术、Western blot和RT-PCR等技术检测具核梭杆菌诱导的肠上皮细胞凋亡情况及促凋亡相关蛋白PARP剪切、BECN1、Caspase3剪切和AKT磷酸化的情况。结果具核梭杆菌感染人肠上皮细胞系Caco-2后,无论在转录水平还是蛋白水平,促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达均比对照组显著升高,其中感染6 h后促炎细胞因子表达最高。其次,具核梭杆菌能够诱导Caco-2细胞凋亡,其中感染6 h凋亡率最高;具核梭杆菌感染6 h后,凋亡通路相关蛋白PARP剪切、Caspase3剪切显著增加,BECN1显著上调,而抗凋亡蛋白AKT磷酸化则显著下调。结论具核梭杆菌能够诱导人肠上皮细胞的炎性反应和凋亡。     

微小RNA在免疫调节中的作用研究进展

微小RNA(miRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达.研究证实,miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用.近年来,一系列的miRNA已被证实参与了免疫反应调控,如固有性免疫应答,T、B淋巴细胞的分化,病原体感染与免疫及炎症的免疫调控等.文中就miRNA在固有性与获得性免疫应答中的调控作用作一综述.     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达

目的 通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7的EspA蛋白，并分析其免疫学性质。方法 采用PCR技术从EHEC O157：H7基因组中扩增espA基因，T／A法克隆，连接至pET-28a（＋）载体上，转化宿主细胞E．coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE测定其相对分子质量，同时分析其N端氨基酸序列，免疫家兔鉴定其抗原性。结果 重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同，一致性为99．83％，所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达，表达量约30％。免疫家兔所得抗体滴度为1：32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a（＋）-espA，表达的蛋白具有良好的免疫原性，为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。     

抗重组人白细胞介素18单克隆抗体的制备与特性研究

目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和 1F5 ,染色体数目分别为 92条和 90条 ,所分泌的抗体分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型 ,腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度达 95 %以上 ,效价为 1× 10 - 4和 1× 10 - 5,Westernblot显示 2株单抗均能特异性识别 18 3kD处的rhIL 18蛋白。 1C7单抗的亲和常数Ka=1 7× 10 5,1F5的亲和常数Ka=1 3× 10 5。 2株单抗识别不同抗原表位。结论 :制备的 2株单抗为进一步研究IL 18的分子结构、生物学功能及其与免疫相关性疾病的关系提供了实验材料。     

Stx2B与IntiminC300融合蛋白的构建、表达及免疫保护研究

目的　构建表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 57∶H7志贺毒素Ⅱ结合亚单位 (Stx2B)与紧密黏附素C 端免疫保护性片段 (IntiminC30 0 )的融合蛋白 (Stx2B IntiminC30 0 ) ,并观察其免疫保护作用。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增Stx2B的编码基因stx2b ,T A克隆后在前期已构建原核表达质粒 pET 2 8a( + ) eaeC30 0的基础上构建融合基因表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测 ;通过包涵体洗涤与阴离子柱层析纯化 ,获得目的蛋白Stx2B IntiminC30 0 ,以Al(OH ) 3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠 ,再以EHECO1 57∶H7超声破菌液腹腔注射免疫后的小鼠 ,观察攻毒保护效果。结果　PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增出了约 2 90bp的目的片段 ;原核表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5% ;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 4 3× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。纯化后目的蛋白Stx2B IntiminC30 0的纯度达 75% ,免疫BALB/c小鼠后血清特异性抗体阳转率及抗体效价均显著增高 ,能够抵御致死剂量EHECO1 57∶H7超声破菌     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及初步应用

目的　获取重组表达人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori ,Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位 ,并应用于临床诊断。方法　利用PCR技术扩增HpHspA基因 ,将其构建至PinPointTMXa 3载体中进行诱导表达 ,并对其产物进行SDS PAGE、免疫印迹等检测。同时 ,将纯化的重组蛋白结合ELISA方法对幽门螺杆菌感染患者清除治疗前后血清中的抗HspA抗体进行检测。结果　所克隆的HspADNA由 3 5 4个碱基组成 ,可编码 118个氨基酸残基的多肽 ,SDS PAGE和免疫印迹显示所表达的蛋白分子量约为 14× 10 3 ,并可与相应的抗血清发生特异反应 ;ELISA结果发现 ,消化性溃疡患者在清除治疗后早期只出现明显的抗HspA抗体滴度下降 ,而抗幽门螺杆菌抗体要在治疗后 6月才出现明显下降。结论　重组表达HspA为诊断、预防和治疗幽门螺杆菌的进一步研究奠定了重要实验基础