肠出血性大肠杆菌0157:H7 LexA蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 对EHEC 0157:H7 lexA达、纯化,并检测其免疫活性.方法 lexA基因片段插入表达载体pET22b( ),在E..coli BL21(DE3)中表达.包涵体经洗涤并用8 mol/L尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第-步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定LexA蛋白的浓度,将纯化的kxA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗lexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western blot分析LexA的免疫活性.结果 lexA以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经Heparin Agrose亲合柱层析和凝胶过滤层析两步组合纯化目的 蛋白,经HPLC测定目的 蛋白的最终纯度为98%,表达及纯化的lexA具有良好的免疫活性.结论 在E.coli BL21(DE3)中表达的LexA蛋白具有良好的免疫活性.     

幽门螺杆菌Cag毒力岛

幽门螺杆菌有一长约４０ｋｂ的毒力岛，名为细胞毒素相关基因，编码ＣａｇＡ等毒力因子。具有Ａａｇ毒力岛的幽门螺杆菌在临床上的表现出与胃炎、胃溃疡及胃癌更为密切的关系。本文就幽门螺杆菌的Ｃａｇ毒力岛作一介绍。     

幽门螺杆菌Cag毒力岛

幽门螺杆菌有一个长约40kb的毒力岛,名为细胞毒素相关基因(Cag),编码CagA等毒力因子。具有Cag毒力岛的幽门螺杆菌在临床上表现出与胃炎、胃溃疡及胃癌更为密切的关系。本文就幽门螺杆菌的Cag毒力岛作一介绍。     

临床免疫学与免疫检验课程设计性实验教学的探索与实践

以“酶联免疫吸附试验检测乙肝表面抗原方法的建立”设计性实验的实施过程为例对临床免疫学与免疫检验课程设计性实验教学中的选题、实施、总结及教学方法进行了探索与实践,进一步阐明了设计性实验对学生实践能力、观察能力、分析能力、解决问题能力、创新能力培养的重要作用。     

免疫磁分离及免疫比浊分析对福氏志贺菌的自动快速定量检测

目的 以SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌分别与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备福氏志贺菌特异的多抗磁珠和抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂,利用免疫比浊分析探索其在福氏志贺菌自动快速定量检测中的初步应用.方法 福氏志贺菌F1a免疫日本大耳白兔制备多抗血清,磁珠包被SPA后再与多抗偶联,制成多抗免疫磁珠.以该磁珠捕获模拟标本的福氏志贺菌,接种MH平板37℃培养18～24 h,菌落计数后计算免疫磁珠的特异富集作用.富含SPA的金黄色葡萄球菌(No 1800株)经甲醛灭活后,与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备特异抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在日立7060全自动生化分析仪编制程序进行自动检测并进行初步的方法学评价.结果 福氏志贺菌Fla免疫日本大耳白兔获得了高质量的多抗血清,特异性好,凝集效价达1:320;制备多抗免疫磁珠对福氏志贺菌具有一定的富集作用,菌落计数显示磁珠处理的细菌捕获效率约为30%;抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在玻片上能与待测福氏志贺菌产生明显的凝集现象,在日立7060全自动生化分析仪上定量检测灵敏、特异、线性良好.结论以福氏志贺菌的多抗血清分别致敏SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌,制备特异的多抗磁珠对福氏志贺菌有一定的特异捕获与富集作用,抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂对福氏志贺菌的自动、快速、定量检测具有较好的效果,为病原菌的快速诊断和自动定量分析提供了新的思路.     

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的：评价重组尿酶B亚单位（rUreB）作为幽门螺杆菌（Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法：采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位（CTB）共口服免疫BalB/c小鼠，ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平，体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL－4、IFN－γ的变化。结果：BalB/c小鼠口服rHreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论：rUreB可以作为Hp疫苗成分用于Hp感染的预防和治疗。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素G端免疫保护性片断（Intindn C300）的融合蛋白（EspA-IntiminC300）。方法采用PCR技术从EHEC0157lH7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300，T-A克·隆后依次构建至表达载体pET-28a（＋），转化宿主细胞E．coliBL21（DE3），测序鉴定，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测其表达量及表达形式，亲和层析法纯化目的蛋白，免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC0157tH7基因组中分别扩增出了约580bp（espA）和900bp（eaeC300）的目的片段，将二者融合构建了重组质粒pET-28a（＋）-espA-eaeC300，测序结果与理论预测值一致性为99．9％（1501／1502）。融合蛋白在工程菌中表达量约40％，PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量（Mr）约54×10^3Da，破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形武表达，包涵体洗涤后纯化，获得目的蛋白纯度约90％。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白（EspA-IntiminC300），此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性，为研制EHEC0157：H7多亚单疫苗奠定了基础。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜佐剂的融合表达

目的 :在大肠埃希菌 (E .coli)中表达淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜免疫佐剂的融合蛋白。　方法 :PCR扩增淋病奈瑟菌保守抗原表位porinloopⅥ～Ⅷ (PL678)基因 ,并与不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)融合 ,转化E .coli,ELISA、SDS PAGE及Western印迹分析其表达。　结果 :融合蛋白获得表达 ,具有结合GM1神经节苷酯的能力和与抗淋病奈瑟菌多克隆抗体的反应性。　结论 :融合蛋白的表达为研究淋病奈瑟菌分子内佐剂疫苗奠定了基础。     

基于HSV-1型特异性表位的血清抗体ELISA检测方法建立与初步应用评价

目的建立并评价HSV-1型特异性抗体鉴别诊断的ELISA方法。方法以HSV-1-gG112-127型特异性表位的串联重组表达蛋白作为包被抗原，建立检测血清HSV．1特异性IgG的间接ELISA方法。同时以免疫印迹检测作为“金标准”，评价检测方法的真实性和可靠性。结果采用棋盘法确定了包被抗原、抗体的最佳浓度，建立ELISA检测方法。血清特异性IgG检测的灵敏度为91％，特异度为97．6％，阳性预测值为97％，阴性预测值为93％，符合率为94．5％，试验的一致率为98％。结论用串联重组蛋白作为包被抗原对HSV-1感染的血清进行ELISA分型检测，其特异性好。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。