复方苦参注射液UPLC指纹图谱检测及6种成分含量测定

目的 建立复方苦参注射液的超高效液相色谱法(UPLC)指纹图谱,并同时测定其中6种指标成分的含量。方法 采用ACQUITY UPLC CSH^TM C₁₈(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱,以甲醇2 g·L^-1磷酸二氢钾为流动相梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,柱温30℃,检测波长211 nm。结果 建立复方苦参注射液UPLC指纹图谱,确立了9个共有峰,10批样品相似度均大于0.99。甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、苦参碱、槐果碱、槐定碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱6种成分在相应浓度范围内与峰面积的线性关系良好,平均加样回收率分别为100.42%、100.90%、101.45%、103.85%、99.95%、100.46%,相对标准偏差(RSD)值分别为1.96%、0.67%、1.60%、1.15%、1.02%、1.20%。结论 本研究建立的复方苦参注射液的UPLC指纹图谱及多成分含量测定方法,操作简单,重复性好,稳定可靠,为复方苦参注射液的质量标准研究提供更加全面的依据。     

DEAE—Sepharose阴离子交换柱一步纯化重组人IL—6

目的为了制备高纯度、高活性的重组人白细胞介素-6.方法化学诱导重组表达载体pT7.7hIL-6进行蛋白表达,菌体经超声破碎分离包涵体,并对包涵体进行洗涤、变性和复性处理,用DEAE-SepharoseCL-6B弱阴离子交换柱一步纯化复性的重组人IL-6.采用3H-TdR法测定rhIL-6的活性.结果表达产物经纯化后纯度达95%,比活性为3.0×108U/mg.结论本实验设计的纯化工艺简便易行,所得产品纯度高、产率高.     

流式细胞术检测CIK的免疫表型和体外杀伤活性

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）的免疫表型和体外杀伤活性。 方法:从健康人外周血分离淋巴细胞,经过IFNγ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的CIK。采用流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞来区分效应细胞,再以ＰＩ染色,用FACS检测靶细胞的死亡率。 结果:CIK于第22天达到增殖高峰,并高度表达CD3、CD11a、CD54和HLA-DR;中度表达CD3/CD56、CD25、CD28、CD69和FasL;CD16表达不增加。CIK对肿瘤细胞K562、 HL-60、Hela、SMMC7721和A375均表现出杀伤活性,其中对K562、HL-60、Hela 3种细胞的杀伤作用较强;而对SMMC7721、A375的作用不明显。 结论:细胞因子IFNγ、CD3McAb和IL-2体外诱导的单个核细胞具有强大的增殖力和杀伤活性。     

人肌红蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建人肌红蛋白（Mb）原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白pQE。方法：根据已报道的人Mb基因序列,采用RT-PCR技术从人骨骼肌组织中获得肌红蛋白cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pQpQEE30中并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱 导表达出带有6个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果：序列分析表明,人Mb基因成熟肽编码区含有465 bp,编码153个氨基酸;与GenBank(NM203378) 中已报道的Mb核苷酸序列有98.50 %同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE 电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的31%,相对分子质量约为16 700,并与商品化的人Mb单抗呈特异性反应。经Ni²⁺-NTA agarose 纯化获得SDS-PAGE 电泳下单一条带。结论：在大肠杆菌中获得了人Mb的高效表达。     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

虎眼万年青多糖对小鼠T细胞及其细胞因子IL-2 mRNA表达的影响

目的：探讨天然产物虎眼万年青多糖（S₃）对T细胞及其细胞因子IL-2 mRNA表达的影响,进一步从细胞和分子水平探讨其免疫调节作用机制,为开发这一天然产物提供理论依据。 方法：利用流式细胞术,检测S₃对T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8阳性细胞百分率的影响,并采用RT-PCR方法检测IL-2 mRNA的表达水平。 结果：各剂量组CD3、CD4阳性细胞百分率均有上升趋势,极高剂量组CD3、CD4与对照组比较差异有显著性（P<0.001）,CD8有下降趋势,各剂量组均能显著提高CD4/CD8阳性细胞百分率（P<0.001）;极高剂量组和高剂量组可明显促进脾细胞中细胞因子IL-2的mRNA表达,使表达量增加（P<0.01,P<0.05）。 结论：S₃具有较强的增强机体多种免疫功能的作用。     

复方苦参注射液糖类成分指纹图谱及含量研究

目的 采用HPLC-ELSD建立复方苦参注射液的糖指纹图谱,并同时测定其中果糖、松醇、葡萄糖、蔗糖的含量。方法 采用Prevail Carbohydrate ES(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速为1 mL·min^–1,柱温15℃,漂移管温度为60℃,雾化温度为60℃,以氮气为载气,流速为1.5 L·min^–1。结果 建立了复方苦参注射液糖类成分指纹图谱,确立了6个共有峰,10批样品相似度均>0.95。4种成分在相应的浓度范围内与峰面积的线性关系良好,相关系数均>0.999 6,平均加样回收率(n=9)分别为104.85%,103.40%,105.34%,104.71%,RSD值分别为2.55%,2.98%,1.65%,2.58%。结论 该研究建立的复方苦参注射液的糖指纹图谱及含量测定方法操作简单、重复性好,可为复方苦参注射液的质量标准研究提供更加全面的依据。     

HPLC法测定复方苦参注射液中5-羟甲基糠醛的含量

目的:建立复方苦参注射液中5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量的测定方法。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为Waters XSelect CSH^TMC₁₈(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.05%甲酸水溶液梯度洗脱,流速为0.8m L·min^-1,检测波长为284 nm,柱温20℃,进样量10μL。结果:5-HMF质量浓度在0.022～1.11μg (r=0.9998)范围内质量呈良好线性关系。5-HMF平均回收率为95.6%(RSD=6.70%)(n=9)。结论:本研究方法重复性好,准确度高,可用于复方苦参注射液中5-HMF的含量测定。     

MAGE-1基因疫苗的构建及其免疫学活性的研究

目的：制备MAGE-1基因疫苗，观察该疫苗诱导小鼠脾脏的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞C几活性及产生特异性抗体的影响。方法：应用基因重组技术，构建基因疫苗pcMAGE-1；转染HEK293细胞；RT-PCR及Western blot检测MAGE-1 mRNA及蛋白的表达；pcMAGE-1免疫3次BALB／c小鼠，末次免疫后7日收集血清及脾细胞。流式细胞术检测血清中抗MAGE-1多抗的产生，MTT法检测小鼠CIL杀伤活性。结果：构建的pcMAGE-1转染瑚：K293细胞，RT-PCR表明在MRNA水平有MAGE-1的表达；western blot显示表达产物46kD，与预期一致。基因疫苗免疫组小鼠血清MAGE-1抗体的产生增加，与SMMG7721结合率显著高于对照组（P〈0．05）。杀伤实验结果显示，免疫组小鼠脾细胞对SMMC-7721的杀伤率明显高于两个对照组（P〈0．05）。结论：成功地构建了MAGE-1基因疫苗，该疫苗能够有效地诱导特异性免疫应答。     

脑干梗死38例临床分析

本文对近年来经MRI确诊的38例脑干梗死病例进行临床分析,现报告如下.