结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

结核分支杆菌ESAT6-MPT64融合蛋白的构建及应用性初步研究

目的:构建表达结核分支杆菌ESAT6和MPT64融合蛋白,并评价其在血清学诊断中的价值。方法:PCR法扩增esat6和mpt64基因,构建原核表达载体pProEX HTb-EM,表达、纯化ESAT6-MPT64融合蛋白,Western-blot分析其抗原性。用该重组蛋白ELISA法检测结核病患者血清。结果:原核表达的ESAT6-MPT64融合蛋白约40 000,Western-blot证实重组蛋白与ESAT6和MPT64多克隆抗体特异结合。重组蛋白用于检测结核病患者血清,敏感性为67.7%,特异性为82%。结论:重组的ESAT6-MPT64融合蛋白有可能用于结核病免疫诊断试剂的制备。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rvl733cDNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的 构建结核分枝杆菌（Mtb）休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。 方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS［3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt］（四氮唑蓝盐化合物）法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占比率;LDH法检测CTL（cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞）活性。 结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数（2.00±0.36）高于BCG组（1.1±0.06）（t=3.096,P<0.05）;特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30) SFC/10⁶高于生理盐水组（2.75±1.37）SFC/10⁶（t=4.752,P<0.05）;然而脾淋巴细胞中CD4⁺、CD8⁺ T细胞所占比率［分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%］、CTL杀伤活性［(29.52±1.96)%］都与生理盐水组相当［(16.43±2.02)% (t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)% (t=0.234,P>0.05)、（25.28±2.51）%（t=0.726,P>0.05）］。 结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。