几种SARS DNA疫苗对BALB/c小鼠重要器官影响的组织病理学研究

目的 用组织病理学方法观察几种SARSDNA疫苗对BALB／c小鼠重要器官的影响，为研制安全有效的SARSDNA疫苗奠定基础。方法 用RT-PCR的方法从SARS冠状病毒（SARS-CoV）基因组中扩增出M片段、E片段、N片段和S基因的两个主要片段S1，S2，然后将这些基因片段分别亚克隆至pVAC真核表达载体，制备出几种SARSDNA疫苗pVAC-S1、pVAC-S2、pVAC-M、pVAC-E、pVAC-N。用这些疫苗分别或联合免疫BALB／c小鼠后，取小鼠重要器官心、肝、脾、肺、肾，观察其组织病理学改变。结果 鼠心、脾和肾未见明显的组织病理学异常，但部分小鼠的肝和肺表现出下列病理变化：肝：出现片状肝细胞染色加深和肝细胞核固缩等凋亡早期改变，部分还可见到肝细胞水变性和肝窦变窄甚至消失等病变。肺：肺泡隔增厚，肺泡轮廓消失，或肺组织淤血水肿，甚至出现支气管肺炎改变。同时，在pVAC空质粒对照组也可见个别小鼠出现上述肝、肺病变。结论 由于对肝、肺产生组织病理学异常改变，制备高效、安全的SARS DNA疫苗还有待进一步研究和完善，载体的选择和质粒的用量也是必须加以考虑的问题。     

噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域的应用

198 5年Smith率先将EcoRI内切酶的部分基因片段插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白基因Ⅲ区 ,使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面 ,并建立了噬菌体表面呈现技术 (Phagedisplaytechniques)。在此基础上 ,1990年Scott首次将编码随机序列肽的DNA与丝状噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ整合 ,使随机肽与噬菌体蛋白以融合形式表达 ,并呈现在噬菌体表面 ,从而建立了噬菌体随机肽库技术 (Phagedisplayrandom peptidelibraries)。近年来 ,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的…     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

105例社区2型糖尿病患者个体化干预效果评价

近年来我国的糖尿病发病率和患病率呈上升趋势，现有糖尿病患者4000万人，已位居世界第二，其中95．00％左右为2型糖尿病。由于糖尿病的病程长，预后差和昂贵的医疗费用给家庭和社会带来沉重的负担。因而，控制社区2型糖尿病不仅有利于维护社区居民的健康，也有利于降低医疗费用，合理利用卫生资源。本研究拟通过健康教育，行为和药物治疗等个体化干预方式，以探索社区2型糖尿病干预的有效模式。     

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒，并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术，构建pVAC-GRA4重组质粒；利用脂质体介导转染法，将该重组质粒导入HEK-293细胞，用RT—PCR法及Westem-blot法检测其表达情况；利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB／c小鼠体内细胞，测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4含量，并观察攻毒试验后小鼠存活情况，以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段，成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4；转染GRA4的HEK-293细胞，RT—PCR检测可见一条约987bp的目的条带，表达产物经Western—blot鉴定，其分子量约为41kD，能被特异性免疫血清所识别；经pVAC-GRA4免疫后的小鼠，其CD4^＋T细胞百分率无明显变化（P〉0．05），CD8^＋T细胞百分率明显增加（与pVAC对照组比较P〈0．05，与空白对照组比较P〈0．01）。CD4^＋／CD8^＋比值也较空白对照组明显降低（P〈0．01）；pVAC-GRA4免疫鼠IFN-γ的A值比对照组略高，但差异无显著性（P〉0．05）。IL-4A值各组间无明显变化（P〉0．05）；pVAC-GRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组，死亡小鼠的平均存活时间延长（与空白对照组比较P〈0．05）。结论构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中和小鼠体内细胞中轰基．为弓形出癌苗的进一步研究打下基础．     

弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白4（GRA4）的pET原核细胞表达系统，并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。 方法 利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段，定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a（+），转化大肠埃希菌（E.coli BL21 DE3），以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物，并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，用ELISA检测其特异性抗体滴度。 结果 成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统，其表达产物相对分子质量（Mr）约为 40 000，主要以包涵体形式存在，纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。 结论 利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白，该蛋白具有一定的免疫学活性。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒