分泌型PD-L1真核表达载体的构建、表达及其体外效应的初步研究

目的 构建分泌型PD-L1真核表达载体，并对其生物学活性进行初步研究。方法以RT-PCR方法从孕鼠胎盘中获得程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）配体PD-L1的胞外段基因片段，定向连接于pcDNA3．1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1；用脂质体将重组子导入NTT细胞，转染后的NTT命名为NITp。以Western blot鉴定重组蛋白的表达。MTT比色法检测NITp细胞培养上清对同种混合淋巴细胞培养反应的影响；用ELISA试剂盒检测NITp细胞培养上清对反应性T细胞分泌的细胞因子的影响。结果 RT-PCR得到约730bp目的基因片段，测序结果显示该目的基因与Gen-Bank上的序列相符；Western blot分析提示NTTp分泌性表达目的蛋白；NTTp培养上清可抑制混合淋巴细胞增殖，其效应呈剂量依赖性；反应性T细胞分泌的细胞因子检测结果显示，培养上清中IL-4、IFN-γ、IL-2水平降低，与正常对照组差异有统计学意义。结论 成功构建PD-L1基因真核表达载体pcDNA-PDL1，PD-L1蛋白对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用，并可在一定程度上抑制特异性T细胞的活化。     

人绒毛膜促性腺激素对重组E型选择素介导的细胞粘附的影响

目的 :探讨孕妇羊水、血清和尿液的HCG对E型选择素介导的细胞粘附过程的影响。方法 :测定铬51标记的带有E型选择素配体—唾液酸化的Lewisx(sialyl Lewisx,sLex)结构的肝癌细胞系 ,即HepG2细胞在不同浓度、不同来源HCG存在下和重组E型选择素的粘附能力 ,从而评价HCG对E型选择素介导的细胞粘附过程的影响。结果 :血清和羊水HCG能抑制E型选择素介导的HepG2细胞的粘附作用 ,其抑制作用呈浓度依赖关系 ,相对抑制力分别为纯四糖结构sLex 的 2 4× 10 4和 4 5× 10 3 倍 ;而尿HCG无此作用。结论 :血清和羊水HCG是E型选择素的有效配体。     

bFGF对人脐带间充质干细胞增殖及胶原产生的影响

 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）增殖及I、III型胶原产生的影响。方法：贴壁培养hUCMSCs, 流式细胞术分析其表面标记(CD45、CD34、CD105、CD29和HLA-DR),成脂及成骨诱导其分化,以鉴定其为间充质干细胞,确定bFGF促增殖最适浓度为20 μg/L。分为实验组和对照组,实验组添加 bFGF (20  μg/L) 于DMED/F12培养液中,对照组使用DMED/F12常规培养液。MTT法测定hUCMSCs 存活和增殖能力, 分析bFGF 对hUCMSCs 增殖的影响,RT-PCR测定其I、III型胶原 mRNA的变化;Western blotting测定其I、III型胶原蛋白的含量。结果：MTT生长曲线提示bFGF促进hUCMSCs的增殖。用含与不含bFGF培养基培养的hUCMSCs 均表达 CD29,不表达 CD34、CD45和 HLA-DR,油红O染色和茜素红染色阳性。RT-PCR结果显示了实验组 I、III型胶原mRNA表达较对照组减少(P<0.05)。Western blotting检测结果显示了实验组I、III型胶原蛋白的表达较对照组减少(P<0.05)。结论：bFGF可显著促进hUCMSCs增殖,且不改变细胞的表面标志物表达。bFGF对hUCMSCsⅠ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的表达呈抑制效应,提示其在促进创面愈合的同时可能不会引起Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白沉积,从而减少瘢痕增生。     

姜黄素类似物L50H8 对卵巢癌OVCAR3细胞增殖、侵袭与凋亡的影响及其机制研究

目的:研究姜黄素类似物L50H8对卵巢癌OVCAR3细胞增殖、侵袭与凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:MTT法检测L50H8对细胞增殖的影响;Annexin V/PI双染色流式细胞法检测L50H8对细胞凋亡的影响;Transwell法检测L50H8对细胞侵袭力的影响;Western blot法探讨L50H8影响细胞侵袭的机制:检测其对细胞侵袭相关因子细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147)、基质金属蛋白酶(MMP) 2、MMP9和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响;探讨其诱导细胞凋亡的机制:检测其对内质网应激(ERS)启动因子葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)及前凋亡因子C/EBP-同源蛋白(CHOP)表达的影响。结果:L50H8能显著抑制OVCAR3细胞增殖,24 h的IC50为(3.08±0.08)μmol/L。L50H8能诱导OVCAR3细胞凋亡,其凋亡诱导效应强于姜黄素。Western blot法发现L50H8能下调CD147、MMP2、MMP9及VEGF的表达,上调GRP78及CHOP的表达。结论:L50H8能显著抑制OVCAR3细胞增殖,通过下调CD147、MMP2...     

循环肿瘤细胞与转移性前列腺癌患者预后关系的Meta分析

目的 通过Meta分析系统评价循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）与转移性前列腺癌患者的预后关系。方法 检索PubMed、EMbase、Cochrane图书馆、中国期刊全文数据库（CNKI）及中国生物医学文献数据库（CBM）等,收集患者血液中CTCs数量与前列腺癌Gleason评分0~10级的前列腺癌患者预后相关的研究。以总生存期（OS）为观察终点,采用Review Manager 5.3进行Meta分析。结果 共有10篇英文文献纳入Meta分析,结果显示CTCs阳性组较CTCs阴性组在总生存期（OS）上预后差（HR=2.47, 95%CI: 2.02~3.02, P<0.00001）,根据检测时间与检测方法进行亚组分析,CTCs阳性组比CTCs阴性组患者预后差。同时分析结果还提示CTCs阳性与前列腺癌Gleason评分呈正相关（OR=2.23, 95%CI: 1.41~3.53,P<0.04）。与前列腺癌特异性抗原（PSA）水平、是否有骨外多发转移均无相关性。结论 外周血CTCs阳性是转移性前列腺癌患者预后的风险因素,且与检测时间、检查方法无关。     

真胰岛素与2型糖尿病缺血性心脏病相关关系

目的　探讨真胰岛素水平与 2型糖尿病合并缺血性心脏病的相关关系。方法　将 173例 2型糖尿病患者按是否并发缺血性心脏病 (IHD)分为 2型糖尿病缺血性心脏病组 (IHD)和 2型糖尿病不并缺血性心脏病组(NIHD) ,分析比较两组心血管疾病危险因素。同时采用微粒子化学发光免疫分析法测定空腹真胰岛素 (TI)。根据空腹真胰岛素的测定结果分成空腹高TI组、空腹正常TI组和空腹低TI组 ,比较 3组IHD发生率。采用Logistic回归分析 2型糖尿病合并缺血性心脏病的危险因素。结果　Logistic回归分析显示 ,2型糖尿病合并IHD的发生与性别、胆固醇、载脂蛋白 -a有显著的正相关关系 (P <0 0 5 ) ,尤与载脂蛋白 -a的关系显著 (OR =7 6 9,P <0 0 5 )。空腹TI不构成危险因素。结论　真胰岛素可能与 2型糖尿病缺血性心脏病不独立相关     

P7抑制bFGF诱导的3T3细胞增殖的作用机制

研究从噬菌体随机七肽库中筛选得到的新型bFGF拮抗肽 (P7) 抑制bFGF诱导的Balb/c 3T3细胞增殖的作用机制。采用倒置显微镜观察不同浓度P7对细胞形态的影响; 流式细胞术分析P7对细胞周期的影响; Western blotting检测P7对bFGF刺激的Balb/c 3T3细胞中MAPK通路的MEK、Erk1/2信号分子活化水平的影响。结果显示, 在检测的浓度范围内, P7对Balb/c 3T3细胞形态无显著影响; P7可改变bFGF刺激下Balb/c 3T3的细胞周期, 减少S期细胞比率, 使细胞阻滞在G₀/G₁期; 并以剂量依赖的方式下调bFGF激活的MEK、Erk1/2信号分子的磷酸化水平。P7可能通过阻滞细胞在G₀/G₁期, 下调MAPK通路信号分子的活化水平, 从而抑制bFGF诱导的Balb/c 3T3细胞增殖。     

莪术醇的分离鉴定及含量测定

目的：研究从莪术油中提取莪术醇的方法，建立莪术醇含量分析的新方法。方法：以莪术油为原料，进行减压蒸馏，收集208—216℃的馏分经重结晶得到产品，将其和对照品作差示量热光谱、红外光谱、核磁共振和质谱对比分析确定莪术醇；用高效液相色谱法测定其含量，色谱柱为ODS柱；以乙腈：水（15：85，V：V）为流动相；流速为1．0mL/min；检测波长为210nm；柱温为25℃；以外标两点法计算含量。结果：经差示扫描量热光谱、红外光谱、核磁共振、质谱分析鉴定提取的产物是莪术醇，高效液相分析其浓度在10—70μg／mL范围内线性关系良好，相关系数r=0．9999（n=7）；精密度试验RSD为0．92％（n=6）；平均回收率为99．86％，RSD=0．76％，含量为98．9％，RSD=0．89％（n=3）。日内日间差异实验RSD均小于0．78％，表明样品稳定性良好。结论：减压蒸馏法提取莪术醇的工艺流程简单，适合大规模生产，而且纯度高；高效液相色谱法测定莪术醇含量的方法简便、准确、快速，可用于莪术醇及其制剂的质量控制。     

bFGF对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤的影响。方法：48只大鼠分为正常I/R＋生理盐水组（CN）、正常I/R＋bFGF组（Cb）、糖尿病I／R＋生理盐水组（DN）、糖尿病I/R＋bFGF组（Db）。以腹腔注射链脲佐菌素（STZ）法建立糖尿病模型，以结扎冠状动脉左前降支法建立I/R模型。每组6只颈动脉取血，离心得血清，以丙酮酸二硝基苯腙显色法检测乳酸脱氢酶（LDH）活性，硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛（MDA）含量。颈动脉取血后取心脏做心肌组织石蜡包埋，免疫组化染色检测第Ⅷ因子的表达，计算心肌血管数量。每组剩余6只取心脏做TTC染色，计算心肌梗死面积。结果：WR后，Cb组和Db组心肌血管数高于对应的CN组和DN组，LDH活性和MDA含量低于CN组和DN组；战组心肌血管数低于CN，组，DN组LDH活性和MDA含量高于CN组；Db组心肌血管数低于Cb组，而LDH活性和佃A含量高于Cb组。结论：糖尿病大鼠I/R后心功能受损和梗死程度比正常大鼠严重，补充bFGF可以改善心功能和减少心肌梗死面积，但疗效不如非糖尿病组。     

1型糖尿病与基因治疗

1 型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）是由于自身免疫机制引起胰岛β细胞破坏，胰岛素分泌缺乏。胰岛移植治疗糖尿病是研究的热点之一，但供体来源不足和免疫排斥仍是亟待解决的问题。随着基因重组及转基因技术的不断发展，再造分泌胰岛素的克隆细胞，或特异性阻断针对胰岛自身免疫过程治疗T1D，为T1D治疗提供新的研究方向。