重组人碱性成纤维细胞生长因子突变体[Ser~(69,87)]的表达、纯化及其稳定性研究

目的:对野生型人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)进行突变改造以提高其稳定性.方法:采用PCR突变方法,将hbFGF cDNA第69位和87位的Cys密码子突变为Ser密码子,所得的突变片断插入表达载体pET3c的表达框架中,构建了表达菌株BL21(DE3)/pET3c-[Ser69,87]hbFGF,IPTG诱导表达.通过离子交换、肝素亲和两步层析的方法分离纯化突变体蛋白[Ser 69,87]hbFGF.MTT法测定重组蛋白的促分裂活性.并对突变体蛋白的抗蛋白酶水解能力、热稳定性及其酸碱稳定性进行了检测.结果:所构建的表达菌株,其[Ser69,87]hbFGF的表达量占菌体总蛋白的30%以上.经两步层析纯化,获得了纯度达98%的突变体[Ser69,87]hbFGF.纯化的样品促Balb/c 3T3细胞增殖的活性与野生型hbFGF相当.突变体[Ser69,87]hbFGF抗胰蛋白酶水解的能力较野生型hbFGF强;热稳定性和酸碱稳定性也较野生型hbFGF高.结论:突变体[Ser69,87]hbFGF的生物学活性与野生型hbFGF相当,其稳定性明显高于野生型hbFGF.     

一种合成人血小板因子4基因的简便有效方法

目的:用一种简便有效的方法合成hPF4基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达.方法:根据hPF4基因的序列,用touch-down PCR的方法合成hPF4基因,将合成的基因片断克隆到表达载体pCEX-4T-1中,构建了重组质粒pGEX-4T-1-hPF4,并将之转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达由谷胱甘肽转移酶和hPF4组成的融合蛋白.结果:用touch-down PCR的方法成功合成了hPF4基因.融合蛋白形成包含体,表达量约为全菌体蛋白的30%.结论:Touch-down PCR方法可作为合成其它目的基因的简便有效方法.BL21(DE3)/pGEX-4T-1表达系统能高效表达合成的hPF4基因,为下一步hPF4的纯化与生物学活性研究打下了基础.     

人类重组型酸性成纤维细胞生长因子促分裂效应及其信号转导途径的推测

[目的]通过比较野生型及重组型酸性成纤维细胞生长因子(waFGF,raFGF)对NIH3T3细胞促分裂活性的差别,推测其信号途径的异同,从而评价促分裂性;同时,通过检测肝素(HS)对这两种生长因子生物学活性的影响,评价其在模仿机体内环境中的作用.[方法]应用MTT法检测细胞的促分裂活性.应用Western blot和RT-PCR分别检测FGF1受体磷酸化和Fos基因表达.[结果]raFGF对细胞增殖的作用明显低于waFGF,在5～80mg/mL范围内最为明显(P＜0.001);HS均可促进两种因子对细胞的增殖作用,但raFGF+HS组明显低于waFGF+HS组(P＜0.05).waFGF通过核转位和MAPK两种途径发挥促分裂活性,而raFGF则只通过MAPK发挥促分裂性.[结论] raFGF的促分裂作用低于waFGF;肝素对这两种因子的促分裂性具有促进作用;waFGF通过核转位和MAPK两种途径发挥促分裂活性,而raFGF则只通过MAPK发挥促分裂性.     

姜黄素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的双重作用

目的研究姜黄素(Cur)对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞ECV304的作用及可能机制;方法胎盘兰计数法分组观察在不同的时间点加入姜黄素后对H2O2诱导的ECV304细胞氧化损伤的作用。流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化,试剂盒检测一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超歧化物氧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性的变化。结果姜黄素0~100μmol·L-1与H2O2500μmol·L-1同时作用5h,随姜黄素浓度升高细胞存活率升高;25~100μmol·L-1姜黄素预先作用1h,再换为H2O2500μmol·L-1作用4h,细胞存活率明显下降;H2O2500μmol·L-1作用4h,再加入25~100μmol·L-1姜黄素作用1h,细胞存活率也升高。姜黄素对H2O2诱导的细胞凋亡没有明显的影响,但同时作用组、H2O2先作用组S期细胞所占比例升高,姜黄素先作用组S期细胞所占比例下降。同时作用组、H2O2先作用组的SOD、NO、GR水平相对升高,MDA水平下降,姜黄素先作用组的SOD、NO、GR水平相对下降,MDA水平升高。结论姜黄素对H2O2诱导的血管内皮细胞ECV304有双重效应,即有保护效应也有细胞毒效应,与其作用时间点有关。     

肝细胞生长因子拮抗放线菌素D诱导的肝细胞凋亡及机制探讨

目的： 探讨肝细胞生长因子（HGF）对放线菌素D (ActD)诱导HL7702肝细胞凋亡的拮抗作用及可能机制。 方法： 本实验采用HL7702正常人肝细胞株，MTT法检测ActD对肝细胞存活力的影响；Hoechst33342进行凋亡形态学染色；DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡数量；Western blotting方法检测细胞总Akt及磷酸化Akt蛋白的表达。 结果： ActD可以诱导HL7702肝细胞凋亡，其浓度在0.25-8 mg/L范围内呈现剂量效应关系；PI3K特异性抑制剂wortmannin能够增强ActD诱导的肝细胞凋亡作用；肝细胞生长因子(HGF)对ActD诱导的肝细胞凋亡有拮抗作用，在一定剂量范围内呈现剂量效应关系；并且HGF能够激活PI3K/Akt信号转导途径；进一步用wortmannin阻断PI3K/Akt信号途径后，HGF的拮抗凋亡作用被抑制。 结论： 一定剂量的ActD可以诱导肝细胞凋亡；wortmannin能够增强ActD诱导肝细胞凋亡的作用；HGF对ActD诱导的这种细胞凋亡有明显的拮抗作用，并且HGF的抗凋亡作用与其激活细胞内PI3K/Akt信号转导通路有关。     

角质细胞生长因子对老龄鼠胸腺细胞增殖作用的研究

目的观察角质细胞生长因子（KGF）通过恢复胸腺上皮细胞（TEC）数量促进老龄鼠胸腺细胞增殖的作用。方法①体内实验：BALB／C小鼠10只，随机分为KGF处理组和对照组，每组各5只，连续7d分别给予皮下注射重组人KGF（5mg·k^-1·d^-1）和生理盐水，4周后检测小鼠胸腺和脾组织的细胞总数，流式细胞仪分别检测胸腺组织中CD4单阳性（CD4SP）、CD8单阳性（CD8SP）、CD4CD8双阳性（DP）、CD4CD8双阴性（DN）以及脾组织中CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的比例；②体外实验：鼠胸腺上皮来源的1C6细胞，分别经含不同浓度（25、50、100、200、400、800ng／ml）的重组人KGF和不含重组人KGF的完全培养液（对照组）作用24h，采用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖率。结果细胞计数和流式细胞仪检测显示，与对照组相比，KGF处理组平均胸腺细胞总数和CD4SP、CD8SP、DP、DN各T细胞亚群的平均细胞数以及KGF处理组平均脾细胞总数和CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的平均细胞数均有明显增加（均P〈0．05）。MTT法检测显示，在低浓度（〈200ng／ml）时，1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加不断升高；当KGF浓度为200ng／ml时，1C6细胞增殖率达到最高值；而在高浓度（〉200ng／ml）时，1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加又逐渐下降；与对照组比较，浓度为100、200、400ng／ml的重组人KGF对1C6细胞具有明显的促增殖作用（均P〈0．05）。结论KGF可通过恢复老龄鼠TEC数量以及促进胸腺细胞生成和增加成熟T细胞向外周输出而增强机体的免疫力。     

莪术油注射液协同治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)可行性浅析

当前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的治疗尚无特效药,国家医疗救治主管部门陆续发布多个针对COVID-19的诊疗方案。莪术油及其制剂在抗病毒、治疗肺纤维化等方面的疗效已被多项基础研究及临床应用所证实,推测在COVID-19的临床治疗中可试用莪术油注射液,特别是治疗肺间质改变造成的肺纤维化、促进止泻、减少患者发热时间等。此外,与抗病毒、抗生素等临床配伍使用的经验提示,莪术油注射液可用于减少COVID-19患者在治疗过程中药物引发性肝损伤,提高治疗效果。为莪术油及其制剂在协同治疗COVID-19中的科学使用提供理论依据。     

人类重组酸性成纤维细胞生长因子对细胞增殖和凋亡的影响

目的：通过对人类重组型和野生型酸性成纤 维细胞生长因子（raFGF，waFGF）的比较研究，探讨raFGF与促分裂性有关的生物学作用。 方法：应用NIH3T3细胞株，用MTT法通过细胞增殖实验检测waFGF和raFGF 的促分裂性，通过流式细胞术检测细胞凋亡、细胞膜通透性和线粒体膜电位。同时检测肝素 （HS）对aFGF生物学作用的影响。结果：raFGF对细胞增殖 作用明显低于waFGF。raFGF对细胞凋亡的抑制作用及其对细胞膜通透性的增强作用也明显低 于waFGF，对线粒体膜电位的增强作用明显低于waFGF。HS对aFGF的生物学作用具有促进作用 。结论：raFGF的促分裂作用低于waFGF，而对细胞凋亡的影响不明显。     

姜黄素对紫外线氧化损伤人角质形成细胞的保护作用

目的 研究中波紫外线(UVB)照射所致人角质形成细胞的氧化损伤以及姜黄素(curcumin,Cur)对其损伤的抗氧化防护效果.方法 在角质形成细胞培养的基础上,实验组经30 mJ/cm2 UVB照射后,加入不同剂量的Cur(1.25 ～5.0 μg/ml),继续培养18 h,采用生物化学法测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和乳酸脱氢酶(LDH)活性及丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量.结果 人角质形成细胞经UVB照射后加入Cur,与UVB照射组比较,ROS和MDA含量明显降低(P＜0.05),并显示Cur剂量-效应关系;而SOD和GSH-Px显著增高(P＜0.05),LDH活性显著降低(P＜0.05),均显示其剂量-效应关系.结论 Cur能增加细胞内抗氧化酶活性,抑制脂质过氧化反应,具有对UVB照射所致人角质形成细胞的氧化损伤防护作用.