结直肠癌MTAP基因的表达及启动子去甲基化的研究

背景与目的：研究报道甲硫腺苷磷酸化酶（5’-methylthioadenosine phosphorylase,MTAP）在多种肿瘤组织中出现异常表达。本研究检测MTAP基因在结直肠腺癌、结直肠腺瘤和正常结直肠粘膜组织中的表达以及MTAP启动子甲基化的改变,探讨结直肠癌MTAP基因表达的变化与启动子去甲基化的关系。方法：定量PCR检测50例结直肠癌及癌周正常组织中MTAP mRNA的表达量;免疫组织化学的方法检测MTAP在结直肠癌中的表达;甲基化特异多聚酶链反应（Methylation—specified PCR,MSP）检测正常肠粘膜和结直肠癌组织中MTAP基因启动子发生甲基化的情况。结果：定量PCR结果显示：正常结直肠组织中MTAP mRNA的相对水平显著低于结直肠癌组织（P〈0．01）：免疫组织化学结果显示MTAP在结直肠腺癌中的表达高于结直肠腺瘤及正常结直肠粘膜（98．00％vs．85．00％和12．50％,P〈0．05）,结直肠腺瘤与正常结直肠粘膜差异亦具有统计学意义（P〈0．01）;MSP检测16例正常结直肠组织,20例结直肠腺瘤,50例结直肠癌组织启动子甲基化频率分别是93．75％,75．00％,32．00％。结直肠癌中甲基化率较腺瘤和正常组织均显著降低（P〈0．01）。结论：MTAP在结直肠腺癌组织中的表达高于腺瘤和正常组织,MTAP在结直肠腺癌组织中高表达可能与MTAP启动子去甲基化有关。     

非小细胞肺癌中FHIT基因异常甲基化对其蛋白、mRNA表达的影响

背景与目的 脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)是一种新的抑癌基因,其启动子甲基化在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用.本研究的目的 是通过检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中抑癌基因FHIT启动子CpG岛异常甲基化和蛋白、转录表达情况及其相互关系,探讨FHIT基因在NSCLC发生发展中的作用.方法 应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)、免疫印迹(Western Blot)及RT-PCR测定52例NSCLC组织及其癌旁正常组织(>5 cm)中FHIT的甲基化、蛋白表达和转录水平.结果 NSCLC癌组织中FHIT甲基化率为38.46%(20/52),在癌旁正常组织中FHIT甲基化率为7.6996(4/52),两者差异存在统计学意义(P<0.05);癌组织中FHIT蛋白表达率为28.8%(15/52),癌旁正常组织FHIT蛋白表达率为88.5%(46/52),两者差异存在统计学意义(P=0.000);FHIT mRNA在癌组织中表达率为51.9%(27/52),在癌旁正常组织中全部表达,且表达量明显高于癌组织(P=0.000).结论 在NSCLC中,FHIT基因启动子甲基化频率明显升高,其蛋白表达率明显下降,mRNA表达率下降,提示FHIT启动子甲基化在肺癌的发生和发展中起着一定作用,而且FHIT基因的甲基化与蛋白及mRNA的表达存在一定的关系.     

Cx43基因启动子去甲基化与乳腺癌MDA-MB231细胞上皮间质转换的相关性研究

目的:探讨乳腺癌细胞中连接蛋白43(Cx43)基因启动子甲基化与乳腺癌上皮间质转化(EMT)的关系.方法:甲基化PCR检测Cx43启动子甲基化的频度;5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-Dc)培养乳腺癌MD-MBA-231细胞后,反转录PCR(RT-PCR) 乳腺癌细胞中Cx43 Mrna,免疫荧光、蛋白质印迹法检测E-cadherin、波蛋白(vimentin)及Cx43蛋白表达,甲基化PCR检测启动子甲基化的变化.结果:在应用5-Aza-Dc处理前,MD-MBA-231Cx43基因呈甲基化状态,将4.0 μmol/L的5-Aza-Dc作用48 h后,乳腺癌细胞Cx43基因甲基化逆转;Cx43 Mrna表达水平增加,为对照组的6.5倍.蛋白质印迹检测结果显示,Cx43蛋白相对灰度值为4.3±0.2,明显高于对照组.处理组细胞E-cadherin表达增加,vimentin表达下调.结论:5-Aza-Dc能逆转乳腺癌细胞MD-MBA-231的Cx43基因异常甲基化,促进Cx43基因的再表达,在一定程度上逆转乳腺癌MDA-MB231细胞EMT.     

双歧杆菌对兔VX2瘤HIF-1α和VEGF表达的影响

目的：探讨青春型双歧杆菌对兔VX2瘤组织HIF-1α、VEGF表达的影响。方法：建立兔荷VX2瘤模型20只，随机分成2组，每组10只。对照组经耳缘静脉注射生理盐水，实验组经耳缘静脉注射青春型双歧杆菌。处死动物，取出脏器和肿瘤组织粉碎后进行厌氧培养和革兰染色，观察双歧杆菌对肿瘤的靶向性；另取部分肿瘤组织H—E染色观察肿瘤组织的形态学变化；应用免疫组织化学方法分别检测肿瘤组织中HIF-1α、VEGF的表达。结果：青春型双歧杆菌能够靶向定植于肿瘤组织中；经双歧杆菌治疗后实验兔肿瘤组织坏死面积明显增加。免疫组化显示实验兔VX2瘤组织中HIF-1α、VEGF阳性表达细胞密度显著低于对照组（P〈0．05），且两组中HIF-1α与VEGF的表达呈显著正相关（r=0．86）。结论：青春型双歧杆菌能够在兔VX2瘤组织中靶向定植，且能下调兔VX2瘤中HIF-1α和VEGF的表达。     

芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究

探讨芪参益气滴丸（QS）对大鼠心肌缺血再灌注时,心肌细胞尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）长链非编码RNA、凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法结扎SD大鼠冠状动脉左前降支,造成心肌缺血40 min后剪断结扎线,再灌注120 min,复制实验性心肌缺血再灌注模型,将36 只大鼠随机分为假手术组（只穿刺不结扎,Control 组）、缺血再灌注组（I/R 组）、QS 干预组（QS+I/R 组）,术后采用原位末端标记法检测心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量聚合酶链反应分析并检测3 组大鼠心脏组织中UCA1 的表达,Western blot 检测p27 蛋白表达水平。结果QS+I/R组的细胞凋亡数与I/R 组比较,差异有统计学意义（p <0.05）;与I/R 组比较,QS+I/R 组UCA1 整体表达水平上升,而p27 蛋白减少（ p<0.05）;并且UCA1 与p27 蛋白的表达呈负相关。结论QS 能降低大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡率,其可能通过上调UCA1 水平,减少p27 蛋白表达,保护损伤的心肌细胞。     

17β-雌二醇逆转乳腺癌耐药蛋白介导的多药耐药机制

目的 探讨17β-雌二醇逆转乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的非典型多药耐药的机制.方法 分别通过药物诱导和转基因的方法建立由BCRP和巨细胞病毒(CMV)启动子启动表达BCRP的两种耐药细胞系MCF-7/MX20和MCF-7/BCRP,将耐药细胞培养在含有17β-雌二醇的培养基中,通过细胞毒性实验,外排实验以及定量PCR观察对不同耐药细胞系的逆转作用.结果 培养基中加入17β-雌二醇48 h后,MCF-7/BCRP细胞中的米托蒽醌的强度明显低于MCF-7/MX20,MCF-7/BCRP细胞中BCRP mRNA的含量明显高于MCF-7/MX20.17β-雌二醇可以抑制细胞中BCRP的表达和功能,但是不能抑制MCF-7/BCRP细胞中BCRP的表达和功能.结论 17β-雌二醇不是作为BCRP的底物而抑制BCRP功能的,而可能是通过调控BCRP基因的启动子发挥作用.     

硬膜外留置导管连续液压药物灌注疗法治疗颈椎病的研究

目的探讨硬膜外留置导管连续液压药物灌注疗法治疗颈椎病的疗效及其机理。方法通过对80例颈椎病病人（神经根型31例、椎动脉型15例、脊髓型3例、交感型12例、混合型19例）应用连续硬膜外穿刺,用0.9%生理盐水、麻醉药、山莨菪碱、脉络宁或川芎嗪、当归注射液、透明质酸钠、5%碳酸氢钠等配制的不同药液,经留置导管灌注（输入或推入）,连续用7~10天,对因疼痛产生心因性障碍者则加用东莨菪碱、艾司唑仑。结果经12个月~24年的随访,根据Macnab标准进行疗效评定,优：75例,占93.75%;良：5例,占6.25%,优良率100.00%。4个疗程1例,占1.25%,2个疗程8例,占10.00%,1个疗程71例,占88.75%。结论硬膜外留置导管连续液压药物灌注产生流体剪切应力,符合椎间盘生理性大气压,能促进蛋白多糖、胶原纤维的合成代谢,降低退变椎间盘突出组织分泌的各种炎性介质浓度,抑制对基质的降解或分解,是一种行之有效的治疗方法。     

乳腺癌细胞中E1AF、MMP-2、VEGF的表达及意义

目的探讨乳腺癌发生侵袭和转移的分子机制。方法应用免疫细胞化学技术检测雌激素受体阳性（ER＋）乳腺癌细胞MCF-7和雌激素受体阴性（ER-）乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435s中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、血管内皮生长因子（VEGF）表达,采用RT-PCR法检测细胞株中E1AF mRNA表达。结果 MDA-MB-231中E1AF mNA、MMP-2及VEGF表达水平均明显高于MCF-7和MDA-MB-435s,且E1AF表达与MMP-2、VEGF呈正相关。结论 MMP-2、VEGF与E1AF在肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用,其机制可能在转录水平调节基因表达,增加肿瘤侵袭性。E1AF可能是乳腺癌侵袭转移的重要因子。     

表达BCRP的卵巢癌耐药细胞系3AO/BCRP的建立及其生物学特征

目的探讨乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在卵巢癌中的作用和逆转其介导的MDR,建立表达BCRP的耐药细胞系3AO/BCRP。方法提取MCF-7细胞的总RNA,设计BCRP基因上下游引物,RT-PCR克隆出BCRP基因全长并连接到pcDNA3.1(-)上,转染3AO细胞后以G418筛选存活细胞。采用米托蒽醌外排实验、细胞毒性实验、细胞群体倍增时间、定量PCR、Western blot等方法鉴定构建的耐药细胞系。结果3AO/BCRP对米托蒽醌耐药指数增加至11.58;耐药细胞外排米托蒽醌的作用增强;细胞中BCRPmRNA的水平升高,细胞能表达一定量的BCRP。结论3AO/BCRP细胞具有BCRP的耐药表型,可作为进一步研究BCRP的生物学特性以及建立其介导的耐药逆转模型。