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目的构建miR-132真核表达载体和融合靶基因FOXA1表达载体,在食管癌细胞KYSE150中验证miR-132对靶基因 FOXA1的调控作用。方法根据miR-132序列在基因组中的位置及其上下游序列,以EC9706细胞基因组DNA为模板,扩 增包含miR-132前体序列,克隆到pMD18-T Simple中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pcDNA3.1(+)上;通过 Real-time PCR检测转染重组表达载体pcDNA3.1-miR-132的KYSE150成熟miR-132的表达水平。用生物信息学软件对 miR-132的靶基因进行预测,将候选靶基因FOXA1的3′UTR区融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基 因检测分析miR-132对靶基因FOXA1的调控作用。将pCDNA3.1-miR-132表达质粒转染人食管癌细胞KYSE150,通过 Western blot检测miR-132对FOXA1蛋白表达的影响。结果成功构建了miR-132真核表达载体,Real-time PCR验证表 明pCDNA3.1-miR-132在KYSE150细胞中能够显著地过表达成熟miR-132。生物信息学预测FOXA1可能是miR-132的靶基 因。双荧光素酶报告基因分析表明miR-132能够作用于FOXA1的3′UTR。Western blot进一步证实miR-132能够抑制 内源性FOXA1蛋白的表达。结论FOXA1是miR-132直接调控的靶基因。 相似文献
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目的:分析影响非小细胞肺癌(NSCLC)纵隔淋巴结转移的相关危险因素,构建风险预测模型并验证其预测能力。方法:收集2017年10月-2018年8月唐山市人民医院行手术治疗的159例NSCLC患者病例为建模组,通过单因素和多因素Logistic回归分析筛选出纵隔淋巴结转移的独立危险因素。根据各危险因素权重,构建风险预测模型。通过受试者工作特征(ROC)曲线下面积评估模型的准确性。收集2018年9月-2019年3月的84例NSCLC患者病例为验证组,验证模型的预测效能。结果:多因素Logistic回归分析显示肿瘤部位、分化程度、胸膜侵犯、脉管侵犯是影响NSCLC纵隔淋巴结转移的独立危险因素(P<0.05)。根据Logistic回归分析,可得回归方程:P预测=-1.29+0.141X1+0.763X2+0.7442X3+0.1325X4,X1:肿瘤部位(1=中央型,2=周围型)、X2:分化程度(1=低分化,2=中分化,3=高分化)、X3:胸膜侵犯(1=有,0=无)、X4:脉管侵犯(1=有,0=无)。ROC曲线的Youden指数最大值为0.523,截断值为0.678,敏感性为71.3%,特异性为29.1%,曲线下面积为0.80。将验证组患者各因素带入预测模型,检验该模型预测效能,结果发现,ROC曲线下面积为0.86,Hosmer-Lemeshow拟合优度检验显示,χ2=2.45,P=0.96。模型拟合优度好,预测价值高。结论:影响NSCLC纵隔淋巴结转移的高危因素多,临床应进行及时有效评估。本研究构建的预测模型有较好的评估效能,有一定的临床应用价值。 相似文献
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1986年~1995年,我院行胃大部切除术378例,125例采用荷包包埋法关闭十二指肠残端,无1例发生残端瘘。现报告如下。临床资料:本组男110例,女15例。年龄20~39岁46例,40~59岁70例;60岁以上9例。其中胃溃疡9例,胃溃疡并急性穿孔10例,胃溃疡并出血18例,十二指肠球部溃疡并急性穿孔20例,球部溃疡合并不全梗阻43例,胃癌25例。方法:常规游离胃大小弯至幽门下2~3cm,于十二指拟切断处两肠钳间切断十二指肠,将胃翻向左侧,以利暴露、充分游离十二指肠球部,用7号丝线先贯穿结扎,在距残端结扎线外1~1.5cm处行荷包缝合将十二指肠残端包埋,残端包埋不满意… 相似文献
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背景与目的关于髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性关系已有广泛研究,但研究结果不一致。本研究利用meta分析的方法探讨髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性的相关性。方法全面检索公开发表的关于髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性关系的研究,把研究人群分为高加索人群和东亚人群,以病例组与对照组比值比(odds ratio,OR)为效应指标,应用meta分析软件RevMan4.2分别计算两种人群的合并OR值及95%CI,同时给出meta分析森林图和倒漏斗图。结果纳入文献研究20篇,其中高加索人群研究纳入病例5381例,对照5827例;东亚人群研究纳入病例1558例,对照1755例。计算高加索人群及东亚人群髓过氧化物酶基因-463位点AA+AG/GG合并OR值,分别为0.91(95%CI:0.81-1.02)、0.83(95%CI:0.63-1.09),高加索人群有发表偏倚,东亚人群没有发表偏倚。结论髓过氧化物酶基因G-463A多态性与肺癌易感性在高加索人群及东亚人群均不具有明显相关性,东亚人群研究样本量少,有待进一步研究。 相似文献
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目的:构建hsa-miR-223真核表达载体, 并在人食管癌细胞KYSE-150中验证hsa-miR-223对靶基因artemin (ARTN)的调控作用。方法: 以基因组DNA为模板, RT-PCR扩增包括hsa-miR-223前体序列在内的基因序列, 并将其克隆到载体pCD?NA3.1 (+) 上, 通过实时定量PCR方法检测hsa-miR-223在人胚肾HEK293细胞中的表达。根据生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对hsa-miR-223靶基因进行预测, 将靶基因ARTN的3'UTR区融合到pMIR荧光素酶基因下游, 通过双荧光素酶报告基因检测hsa-miR-223对靶基因ARTN的3'UTR区的调控作用。将pCDNA3.1-miR-223表达质粒转染人食管癌细胞KYSE150, 通过Western blot检测对ARTN蛋白表达的影响。结果: 成功构建hsa-miR-223表达载体pCDNA3.1-miR-223。实时定量 PCR 验证表明 pCDNA3.1-miR-223 在人胚肾 HEK293 中能够明显地过表达成熟 miR-223。生物信息学预测 ARTN 是hsa-miR-223的靶基因, 并构建融合ARTN的3'UTR区表达质粒pMIR-ARTN, 在此基础上对ARTN的3'UTR “种子区” 进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明hsa-miR-223能够作用于ARTN的3'UTR。Western blot法进一步证实ARTN是miR-223的靶基因。结论: hsa-miR-223作用于ARTN的3'UTR可在转录后水平上调控ARTN蛋白的表达。 相似文献
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miR-181a真核表达载体的构建及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的: 构建miR-181a真核表达载体,获得食管癌细胞TE11在其中稳定表达的细胞系,为研究miR-181a的功能以及其在食管癌细胞TE11中的作用机理奠定基础。方法: 根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游250个碱基序列,以293T细胞基因组DNA为模板设计PCR引物,扩增包含miR-181a前体的序列,连接到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后亚克隆到pcDNA3. 1 ( + )中,并对重组质粒进行双酶切和测序分析;鉴定完全正确的重组质粒转染食管癌细胞TE11,用G418 ( 350 mg/L )筛选4周获得miR-181a稳定表达细胞系TE11-miR-181a,提取TE11-miR-181a细胞总RNA,用real-time PCR鉴定pcDNA3. 1 ( + )-miR-181a可在真核细胞中稳定过表达。结果: 成功构建了miR-181a的真核表达载体,并获得了在TE11细胞中稳定表达重组质粒的细胞系TE11-miR-181a。结论: miR-181a真核表达载体在食管癌细胞TE11中稳定高表达,为进一步研究miR-181a在食管癌细胞TE11中的功能及基因调控机制奠定了基础。 相似文献
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miR-181a对人食管癌TE11细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响 总被引:4,自引:4,他引:0
目的:通过构建miR-181a的真核表达载体,研究其对人食管癌TE11细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:以95C细胞基因组DNA为模板,扩增得到miR-181a前体序列,插入表达载体pcDNA3.1(+)克隆获得pcDNA3.1(+)-miR-181a。将真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-181a转染到TE11细胞中,并采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR,RFQ-PCR)对其表达情况进行验证。分别采用MTT法、细胞划痕法和Boyden小室法检测转染重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-181a对TE11细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响。结果:成功构建了插入miR-181a基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-181a;RFQ-PCR检测结果表明,转染pcDNA3.1(+)-miR-181a的TE11细胞能够过表达成熟的miR-181a(P<0.05)。过表达miR-181a的TE11细胞增殖能力、迁移能力和细胞侵袭能力均明显增强。结论:miR-181a在TE11细胞中过表达能够增加细胞的增殖、迁移和侵袭能力,为进一步深入研究miR-181a在肿瘤中的作用机制提供了实验依据。 相似文献
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目的:构建微小RNA(microRNA,miR)-181a的真核表达载体和靶基因PRDM1(encoding PR domain containing1,with ZNF domain)的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用。方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平。应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3’UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM13’UTR的调控作用。将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a。生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3’UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3’UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3’UTR。蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达。结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3’UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因。 相似文献
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目的:探讨hsa-miR-132(miR-132)对人食管癌细胞增殖和侵袭的影响及其可能的机制。方法:构建pCDNA3.1(+)-miR-132表达载体并转染高转移潜能的人食管癌细胞KYSE150,G418筛选稳定过表达miR-132的KYSE150细胞。软琼脂克隆形成实验和Transwell小室实验检测KYSE150细胞的增殖和侵袭,Real-time PCR和Western blotting检测miR-132和叉头框蛋白A1基因(forkhead box protens A1,FOXA1)在KYSE150细胞中的表达,双荧光素酶报告基因分析和Western blotting检测过表达miR-132对FOXA1的调控作用。结果:成功构建pCDNA3.1(+)-miR-132质粒,获得稳定过表达miR-132的KYSE150细胞。亲本KYSE150细胞中miR-132低表达,而FOXA1蛋白高表达。与转染空载体和未转染KYSE150细胞相比,转染pCDNA3.1(+)-miR-132不影响KYSE150细胞的增殖(13.9±0.33 vs 15.4±0.11、17.1±0.20,P>0.05),但细胞体积较小且表面比较光滑;其可显著降低KYSE150细胞的侵袭能力[(55±1.6)vs(129.0±3.1)、(124.0±2.8)个细胞,P<0.01]。miR-132能够作用于FOXA1 3’-UTR,从而抑制内源性FOXA1的表达。结论:食管癌KYSE150细胞低表达miR-132,外源性过表达miR-132可负向调控FOXA1的表达,从而抑制KYSE150细胞的侵袭能力。 相似文献