二甲双胍调控自噬促PD神经细胞修复的研究

目的 观察二甲双胍(metformin)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridine ion,MPP+)诱导损伤的神经细胞SH-sy5y的保护作用,探索二甲双胍治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的作用机理.方法 采用(MPP+)诱导PD细胞模型24h,分组为Control组、MPP+组(800mol)、Metformin组(二甲双胍预保护2h,1mM),以CCK-8检查细胞的存活率,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放情况,细胞免疫荧光观察细胞形态,流式仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax表达以及自噬相关蛋白LC3,p62表达情况.结果 与MPP+组相比,Metfrmin组可促进细胞的存活,减少细胞膜破坏,与MPP+组相比,Metformin组Bcl-2水平升高,Bax表达下降,同时LC3含量升高,p62表达下降.结论 二甲双胍能够减轻MPP+诱导的PD模型细胞的损伤,其机制可能与诱导自噬及抑制细胞凋亡有关.     

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧皮层神经元凋亡和Bcl-2表达的影响

目的　探讨促红细胞生成素 (Erythropoietin ,EPO)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的保护作用。方法　采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉 (MCA)血流 2h ,再灌注 2 4h制成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。将 3 2只雄性SD大鼠随机分成EPO组、缺血再灌注组、假手术组和正常组。于缺血开始时EPO组给EPO 3 0 0 0U/kg腹腔注射 ;缺血再灌注组和假手术组给予等剂量生理盐水。再灌注 2 4h后断头取脑、切片 ,进行HE染色、Bcl -2免疫组化染色和细胞凋亡检测。结果　缺血 2h再灌注 2 4h后 ,EPO组和缺血再灌注组大鼠缺血侧皮层可检测到凋亡细胞 ,且EPO组凋亡细胞数明显少于缺血再灌注组 ,假手术组和正常组未见凋亡细胞 ;EPO组和缺血再灌注组缺血侧皮层Bcl -2阳性细胞数均高于假手术组和正常组 ,与缺血再灌注组相比 ,EPO组Bcl-2蛋白表达显著增高。结论　EPO可抑制缺血再灌注损伤后缺血侧皮层的细胞凋亡 ,其机制可能是通过上调bcl-2基因表达而实现。     

吸烟对多发性硬化病人病情进展影响

目的探讨吸烟对多发性硬化(MS)病人病情进展的影响。方法从2005-01～2010-12,随访三所医院364例临床诊断为MS的病人,分为吸烟组、戒烟组和非吸烟组,根据临床和磁共振成像(MRI)特点,比较各组转化为继发进展型MS的比例、脑实质分数(BPF)和T2高密度病灶体积变化。结果吸烟组与非吸烟组相比,扩展残疾状态量表评分(EDSS)和多发性硬化严重程度评分(MSSS)增加,从复发缓解型MS(RRMS)向继发进展型MS(SPMS)的转化较快,T2加权病灶体积增加,BPF减少。结论研究提示吸烟对MS进展有不利影响,吸烟可加速RRMS向SPMS的转化。     

血尿酸水平对急性缺血性卒中患者血管再通和梗死体积的影响

目的探讨急性缺血性卒中患者血尿酸（uA）浓度的变化对血管再通和梗死体积的影响。方法对176例发病24h内患者,应用弥散加权核磁共振（DWI）检查,证实为前循环急性缺血性卒中。经改良的NIH卒中（mNIHSS）评分5分以上,随访观察血尿酸、尿囊素（尿酸的非酶代谢产物）浓度变化对血管再通和梗死体积的影响。结果66例血管再通患者多数接受溶栓治疗,uA浓度在48h降低,然后逐渐升高呈u行改变,14d时mNIHSS评分降低,UA和尿囊素浓度变化与DWI梗死体积明显相关。结论UA是急性缺血性卒中的一种消耗和再生性抗氧化剂,其浓度的变化与血管再通和梗死体积有关。     

伴凝血障碍的隐源性脑缺血患者的预后分析

目的探讨凝血障碍的隐源性脑缺血患者在二级预防措施下卒中复发的风险。方法对286例诊断为急性隐源性缺血性卒中或短暂性脑缺血发作(TIA)患者,进行遗传学和特殊的凝血检查,包括凝血因子Ⅴ基因突变、抗活化蛋白C、凝血酶原突变、抗凝血酶Ⅲ、蛋白S、抗心磷脂IgG抗体和狼疮类抗凝物。61例(21.3%)有凝血障碍的患者为凝血障碍组,225例(78.7%)患者检查无凝血障碍者作为对照组。平均随访3年,观察二级预防治疗与缺血性卒中或TIA的发病率。随访3年后对复发性缺血性卒中或TIA的Kapaln-meier风险估计。结果凝血障碍组复发风险为14.1%(95%CI 5.3~21.6),而对照组为9.7%(95%CI 4.9~16.1)。Cox回归分析发现两组间无显著性差异(P>0.05),但发病前的脑缺血事件是凝血障碍组和对照组患者复发危险的独立预测因素。结论伴有凝血障碍的隐源性脑缺血患者与对照组相比,没有增加复发的风险,对二级预防治疗也无明显影响。     

携带肝细胞生长因子的腺病毒感染脐带间充质干细胞的实验研究

目的通过检测感染携带肝细胞生长因子(HGF)腺病毒的脐带间充质干细胞(hUC-MSC)内酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT)和多巴胺(DA)的表达水平及动态变化,探讨hUC-MSC在HGF过表达的情况下是否能向多巴胺能神经元分化,为HGF基因修饰hUC-MSC治疗帕金森病提供细胞基础。方法采用组织块法分离培养hUC-MSC,流式细胞仪检测细胞是否表达间充质干细胞分子表面标志CD29、CD44和CD105;不同感染复数(0、50、100、150、200、400)的携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)感染hUC-MSC后,流式细胞仪检测感染效率,并确定最佳感染复数;运用携带HGF的腺病毒感染hUC-MSC后,细胞免疫酶化学方法检测TH和DAT的表达情况。结果采用组织块法可从脐带中成功分离出(表达间充质干细胞分子表面标志CD29、CD44和CD105)hUC-MSC;Ad-GFP可高效感染hUC-MSC,随着感染复数的升高,感染效率可达99.99%;感染携带HGF的腺病毒(Ad-HGF)后,hUC-MSC可逐渐表达TH和DAT,同时细胞形态也逐渐由纺锤状向多角形和不规则样转变。结论腺病毒可高效感染hUC-MSC;感染Ad-HGF后,hUC-MSC可逐渐向多巴胺能样神经元分化。     

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子联合诱导骨髓基质细胞分化形成神经球

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)联合诱导骨髓基质细胞(MSCs)能否分化形成神经球。方法采用全骨髓法培养MSCs,bFGF和EGF联合诱导MSCs,倒置显微镜下观察分化细胞的形态,免疫荧光法和免疫印迹法鉴定分化细胞。结果 bFGF和EGF联合应用,可有效地诱导MSCs形成神经球。此神经球能传代并分化成神经元样细胞。免疫荧光和免疫印迹法均证实神经球表达nestin蛋白,神经球分化的细胞表达神经元、胶质细胞和少突胶质细胞标志性蛋白。结论 bFGF和EGF联合应用,可有效地诱导MSCs形成神经球。此神经球能自我更新并分化为神经元、胶质细胞和少突胶质细胞。     

米诺环素对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区IκB-α、NF-κB p65表达的影响

目的观察米诺环素对脑缺血再灌注大鼠脑组织IκB-α、NF-κB表达的影响,探索米诺环素脑保护作用机制。方法 72只S-D大鼠,随机分为假手术组(NS组)、脑缺血再灌注模型组(IR组)、米诺环素治疗组(MT组),线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织IκB-α、NF-κB p65的表达。结果相应时间点MT组较IR组IκB-α阳性细胞区灰度值明显增高,NF-κB p65胞核内阳性数明显降低,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论米诺环素可以增加大鼠脑缺血再灌注后脑组织IκB-α表达,减少NF-κB的阳性表达,达到脑保护作用。     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一般以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。 目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006-10/2007-03在重庆医科大学完成。 材料：新生1~3 d 的Wistar大鼠全大脑。 方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液诱导其分化。 主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。 结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。 结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。