一起副溶血性弧菌食物中毒的溯源及毒力基因研究

目的对一起副溶血性弧菌引起的食物中毒病原菌进行分型溯源和毒力基因分析。方法采用荧光定量PCR对分离副溶血性弧菌株检测致热性溶血素TDH基因,并利用脉冲场凝胶电泳进行分子分型,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果从抽检食物中毒样品中分离的5株副溶血性弧菌TDH基因检测结果显示均为阳性;PFGE分型4株副溶血性弧菌带型一致,1株带型与其他分离株有1条带的差异。结论利用脉冲场凝胶电泳对食物中毒病原菌进行分子分型并进行毒力基因检测,为食源性疾病溯源及分子流行病学研究提供科学依据。     

A型流感病毒NP基因核酸疫苗的构建与体外表达鉴定

目的构建A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,研究核酸疫苗主动免疫保护效应。方法从A型流感病毒逆转录获得NP基因,与表达载体pSECTAG2HygroA构建核酸疫苗,采用脂质体转染法转染VERO细胞,经ELISA鉴定,A型流感病毒NP基因核酸疫苗在VERO细胞中得到了表达。结果结果显示,在转染后36h得到最大化表达,其A450达到0.382。在36到60h时间范围内,NP蛋白表达量基本没有变化(在48h和60h的A450分别为0.385和0.387)。结论成功构建了A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,为进一步研究该疫苗体内实验奠定了基础。     

丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建

目的扩增丙型肝炎病毒核心区（HCV-Core）基因，并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物，提取丙型肝炎患者血清中的HCVRNA，应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增c区基因片段，用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后，连接到Pet32a表达载体中，并转化到BL21大肠杆菌中：然后PCR和双酶切鉴定转化茵落。结果扩增得到目的基因长度约600bp，经测序证实为HCV-Core基因，表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core，为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。     

深圳市禽职业暴露人群感染H7N9禽流感病毒血清学调查

目的对深圳市禽职业暴露人群的H7N9禽流感病毒抗体水平进行调查,分析H7N9禽流感病毒感染的危险因素。方法对深圳市大型活禽批发市场和冰鲜家禽零售市场的禽职业暴露人员进行血样采集和问卷调查,用血凝抑制试验检测H7N9抗体,用logistic回归模型分析危险因素。结果 2015—2016年共调查了366名禽职业暴露人员,其中男性245人(66.9%),女性121人(33.1%),年龄中位数44.00岁,血凝抑制试验均未检出H7N9病毒抗体阳性,有23份血清抗体滴度在1:20~1:80之间。问卷调查显示,职业暴露接触的禽种类主要为鸡(93.7%)、鸭(77.6%)、鹅(56.0%),职业暴露人员主要工作为冰鲜家禽销售(52.5%)、活禽销售(27.3%),工作时有95.1%的人穿戴了防护措施,58.7%的人每天对档口清扫2次及以上,67.8%的人每周对档口进行消毒2次及以上。多因素logistic分析发现,女性(OR=2.51,P0.05)、活禽销售(OR=2.76,P0.05)和档口消毒频次较少(OR=3.99,P0.01)是产生抗体滴度的危险因素,具有统计学意义。结论禽职业暴露人群中未发现H7N9抗体阳性,销售活禽和档口消毒频次较少增加了职业暴露者产生H7N9抗体滴度的风险。     

深圳东门市场野生动物SARS病毒的监测

目的　对深圳东门市场野生动物标本中SARS病毒进行监测 ,了解动物携带SARS病毒的情况。方法　对 2 0 0 3年 5月 7日至 12月在东门市场采集的果子狸、貉、鼬獾、猪獾和狗獾等 5种动物标本 ,进行病毒分离鉴定及RT -PCR和SARS荧光定量PCR检测。结果　 5月首先从 4份果子狸和 1份貉标本中分离到SARS病毒。 5月至 12月的 12 1份动物标本中共有 5 5份SARS病毒阳性标本 ,阳性率为 45.45 %。 5月份、10月份、11月份和 12月份野生动物标本中SARS阳性率分别为 50%、83.33%、34.78%和 44.87% ,其中 ,果子狸的SARS病毒携带率为 90 %。结论　东门市场售卖的果子狸可能是携带SARS病毒的重要载体之一 ,在SARS的传播中可能起着重要的作用。     

深圳地区新甲型H1N1（2009）流感病毒M基因特征分析

目的对深圳地区分离到的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因分子特性进行详细分析,并从分子水平上了解其对金刚烷胺类药物的耐药性。方法选取深圳地区分离培养到的55株新甲型H1N1（2009）流感病毒,对其M片段进行全长测序,采用DNAstar与MEGA3．1生物软件对M基因序列进行比对并用NJ法构建系统进化树。结果通过对M基因的氨基酸序列进行进化分析,发现深圳地区分离培养到的新甲型H1N1（2009）流感病毒更接近欧洲猪流感病毒,与季节性HINI流感病毒差异很大。经过序列分析发现,深圳株的M基因与A／California／07／2009高度同源,显示该病毒M基因较保守。此外,还发现所有深圳株的M2蛋白均出现s31N突变,显示对金刚烷胺类药物可能耐药。结论深圳流行的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因可能源于欧洲猪流感病毒,且均对金刚烷胺类药物有耐药倾向。应进一步加强对新甲型H1N1（2009）流感病毒的分子特征研究,并积极开展流感病毒耐药性监测。     

基于RNA聚合酶靶点的抗流感病毒药物筛选系统的鉴定

目的鉴定基于聚合酶亚基间相互作用的靶点特异性抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。方法挑取筛选平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal阳性单菌落（共转化质粒PB1-pGBKT7与PA-pGADT7的AH109酵母细胞）接种培养,PCR验证重组质粒共转是否成功;glass-beads法提取酵母总蛋白,Western-blot验证融合蛋白在酵母细胞中是否表达;将PB1-pGBKT7质粒PB1基因克隆至载体pAcGFP1-C,PA-pGADT7质粒PA基因克隆至载体pProLabel-C,将构建的重组质粒PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel共转染人胚肾GP2-293细胞,Co-IP验证在哺乳动物细胞中流感病毒聚合酶亚基PB1、PA具有相互作用。结果 PB1、PA基因PCR结果均为阳性;PB1-Myc融合蛋白Western-blot结果为阴性,PA-HA融合蛋白Western-blot结果为阳性;PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel重组质粒PCR验证结果 PB1、PA基因阳性;Western-blot检测PB1-GFP融合蛋白阳性;Co-IP结果表明流感病毒RNA聚合酶亚基PB1与PA在哺乳动物细胞内具有相互作用。结论基于RNA聚合酶亚基间相互作用的抗流感病毒药物筛选系统构建成功,可以用于抗流感病毒靶点特异性的高通量药物的筛选。     

甲型流感病毒HA受体结合特异性检测

目的构建甲型流感病毒HA受体结合特异性检测方法,了解当前各亚型流行株受体结合特性。方法以辣根过氧化物酶标记去唾液酸胎球蛋白(Fet-HRP),分别用α-2,3-(N)-唾液酸转移酶和α-2,6-(N)-唾液酸转移酶处理,合成3-Fet-HRP、6-Fet-HRP特异性受体拟合蛋白。分别包被怀槐凝集素(MAA)、接骨木凝集素(SNA)和各亚型流感病毒行ELISA试验进行受体特异性鉴定。结果该检测方法成功建立,各亚型与3-Fet-HRP、6-Fet-HRP均有一定结合。H1N1、H3N2亚型结合6-Fet-HRP的能力高于3-Fet-HRP,禽流感H5N6亚型偏向于与α-2,3受体结合,H7N9亚型对2种蛋白结合能力无明显差异。结论该方法对了解当前流感流行株生物学特性和未来新型毒株的传播方向和风险提供科学预测。     

深圳市2005-2007年H3N2亚型流行性感冒病毒流行病学和分子变异特征

目的 探讨深圳市2005-2007年季节性流行性感冒(简称流感)流行病学特征和甲3亚型流感病毒可能的分子变异.方法 对深圳市2005-2007年流感监测网络(由9所医院、6个区和市疾病预防控制中心共16个主要机构组成)的运行质量进行控制,按周统计分析主要监测医院流感样病例占就诊者的百分比(ILI百分比),并采集流感样病例鼻咽拭子进行流感病毒分离鉴定,对分离到的毒株提取病毒RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增血凝素基因重链区(HAI区)基因片段,产物纯化后测序并进行核苷酸相似性、基因进化树和氨基酸变异分析.结果 深圳市2005-2007年流感活动水平在各年间有所波动,呈现夏季高峰,2006和2007年5-7月为流行高峰期.2005-2007年流感病毒的分离率分别为4.78%(114/2385)、5.77%(212/3674)和12.12%(343/2831),分离毒株数多少与ILI百分比的季节波动相关,按周分离率与ILI百分比的变化趋势基本一致.2005和2006年甲3亚型所占比例分别为25.46%(28/114)和2.83%(6/212),而2007年成为优势毒株,占62.68%(215/343).甲3亚型病毒HA1区序列进化树分析发现,虽然进化树的主干基本按照毒株分离的时间先后发展,与不同年度WHO推荐的疫苗株先后一致,但2005-2007年的主要流感毒株共分为5个分支,2005-2006年毒株在第Ⅰ～Ⅲ分支,2007年4-6月和5-12月形成2个分支,与同期WHO推荐的疫苗株不在一个进化分支,深圳甲3亚型流感病毒的变化较早,出现疫苗株滞后现象.所有毒株未见HA1区序列缺失和插入,受体结合位点和二硫键位点氨基酸也显保守,一些位点出现了不同属性氨基酸的置换,并导致个别潜在的糖基化位点的丢失或增加,但尚不能判定为新变种.结论 深圳市可能属于我国流感病毒变异较早的地区之一,甲3亚型流感病毒在人群中呈活跃状态;常规季节性流感监测与病毒分子变异分析结合,能为毒株的演变及其流行病学意义提供及时、重要的信息.