诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

甲型肝炎IgM抗体快速检测方法的建立

甲型肝炎 Ig M抗体诊断药盒是浙江省医学科学院病毒病研究所的科研成果。自 1991年获得卫生部批准文号使用至今 ,在甲型肝炎病人的早期诊断和流行病学调查中发挥了重要作用。但在临床检测应用中 ,由于该诊断药盒〔1〕存在着检测费时及存放时间较短等问题 ,我们于 1998年 5月至     

SD大鼠角朊细胞分离培养及鉴定

目的 探讨SD大鼠角朊细胞的分离培养技术并鉴定,观察细胞生长情况.方法 采用中性蛋白酶(DispaseⅡ)和胰蛋白酶分离角朊细胞,加入含有10％胎牛血清的角质化细胞专用培养基(keratinocyte serum free,K-SFM)培养.用免疫组化法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法进行鉴定.结果 角朊细胞生长缓慢,原代培养第5天开始出现细胞克隆,核大而圆,培养11天连成片,培养24天长满单层,细胞传代培养比较困难,很难贴壁,经摸索在培养第15天,细胞长满80％左右时即可传代,但一般传3代后就不能再传.大鼠角朊细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)染色,细胞质呈棕褐色,提示培养的细胞CK19阳性.大鼠角朊细胞标志RT-PCR检测整合素β1、CK14(cytokeratin 14)、CK10(cytokeratin 10)的mRNA表达均阳性.结论 用两种酶分离获得的大鼠角朊细胞活性好,降低成纤维细胞污染,用K-SFM培养基培养的细胞经鉴定具有角朊细胞特性,为皮肤组织工程的研究提供良好的种子细胞方面的实验数据.     

兔抗乐果抗血清制备的初步实验研究

目的:对制备兔抗乐果抗血清进行初步研究。方法:采用生产乐果的中间体硫磷酯与1,4-二氨基丁烷反应合成乐果半抗原,利用碳二亚胺法,将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,分别制备免疫原和包被原。将合成的免疫原免疫新西兰白兔6次,制备抗乐果的抗血清。用间接ELISA检测抗血清的效价,用间接竞争ELISA检测与其他结构类似物的交叉反应率。结果:通过偶联,获得免疫原和包被原,半抗原与BSA和OVA的偶联比分别为13∶1和11∶1。免疫原免疫新西兰白兔获得的抗乐果抗血清效价分别为1∶256和1∶128;与氧化乐果的交叉反应率为23%,与其他所测结构类似的农药交叉反应率均小于2%。结论:通过免疫原免疫新西兰白兔,获得抗乐果的抗血清,但其抗血清效价较低,与制备检测试剂盒的要求尚存在较大的差距。     

几丁聚糖纳米微粒分散体系应用于烧伤创面的实验

目的：制备以几丁聚糖为主要原料纳米微粒分散体系，并通过动物烧伤实验进行医学应用效果观察。方法：实验于2003-05／2004-05在浙江省医学科学院医学生物工程研究所及浙江省动物实验中心完成。首先运用物理和化学综合手段，制备几丁聚糖纳米微粒分散体系，用透射电镜观察法进行纳米微粒尺寸测定评估；其次采用制备的几丁聚糖纳米微粒分散体系进行动物烧伤实验，①烧伤动物模型建立：选择体质量2.5～3．0kg健康兔子8只，雌雄对半，脱毛并麻醉后，在实验兔子背部，以脊椎为对称轴，用盛装1130℃开水的人工烧伤器（质量500g），紧贴兔子皮肤3s，制成浅Ⅱ度烧伤创面24个，5s制成深Ⅱ度创面24个，每个创面平均面积16cm^2．左侧创面为实验组，右侧为对照组。②治疗方法：左侧实验组创面涂敷几丁聚糖纳米体系，右侧创面涂敷凡士林，2次／d，上下午各1次，连续3d后停止涂敷，每日观测记录创面的渗出液、创面大小、结痂时间、脱痂愈合时间等临床指标。结果：①几丁聚糖纳米微粒分散体系颗粒粒径平均为（36.40&;#177;5．14）nm。②治疗动物烧伤实验第7天的烧伤创面平均面积试验组小于对照组Ⅰ浅Ⅱ度：（2.29&;#177;0．51）和（4.28&;#177;0．45）cm^2；深Ⅱ度：（2．15&;#177;0.34）和（4．39&;#177;0．52）cm^2，P〈0．01]。③烧伤创面结痂平均时间试验组短于对照组Ⅰ浅Ⅱ度：（6．45&;#177;0．58）和（10．5&;#177;0．75）d；深Ⅱ度：（7．5&;#177;0．66）和（10．6&;#177;0．78）d，P〈0．01]。④几丁聚糖纳米体系对烧伤创面脱痂愈合的平均时间试验组短于对照组Ⅰ浅Ⅱ度：（14．36&;#177;0．58）和（16．27&;#177;0．75）d；深Ⅱ度：（22．0&;#177;1．33）和（29．88&;#177;1．86）d，P〈0．01].结论：几丁聚糖纳米微粒分散体系对动物Ⅱ度烧伤具有明显的缩小创面、提早结痂、促进愈合之疗效，提示具有临床功能敷料的开发应用前景。     

壳聚糖纳米混悬剂的研制和表征

背景:实验于2006-07/2007-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成.壳聚糖(脱乙酰度为87.85%,黏度为195 mPa·s,水分7.13%,灰分0.82%,批号:050621160)由浙江金壳生物化学有限公司提供.运用化学酸解、60Co γ射线辐照、高压、超声波及稳定剂等综合理化手段制备壳聚糖纳米粒子.透射电镜观察制备的壳聚糖纳米粒子为类圆球形;激光动态光散射仪检测壳聚糖纳米粒子平均粒径25.3 nm,占总粒子数99.1%,粒径分布图形较窄,表明颗粒大小均匀.实验结果表明运用以60Co γ射线辐照为主要手段进行壳聚糖纳米混悬剂的制备,是一种简便、快速、无污染、重复性好的方法,具备可行性.     

反义LeETR1转基因番茄的生殖发育毒性及外源基因转移试验

目的 评价反义LeETR1转基因番茄(ETR1)向动物肠道菌群和子代动物转移外源基因的能力及对小鼠生殖发育的影响.方法 SD大鼠和ICR小鼠连续饲喂ETR1、非转基因番茄(B1)和蒸馏水30 d后,分别进行大鼠盲肠菌群培养物的抗生素耐药性试验及小鼠生殖毒性试验,提取耐药阳性菌、亲代和子代小鼠的基因组进行外源基因特异性聚合酶链式反应法(PCR).结果 肠道菌的耐药性和小鼠生殖发育情况无明显改变,在耐药菌和两代小鼠体内均未发现由受试物引入的外源基因.结论 ETR1对小鼠无生殖毒性,其携带的外源基因不能向动物体细胞、肠道菌及子代动物转移.     

大鼠真皮间充质干细胞的分离培养

目的:建立大鼠真皮间充质干细胞的分离培养扩增的方法.方法:用0.25%的胰蛋白酶消化分离表皮与真皮.然后0.1%I型胶原酶消化获得单细胞悬液,离心后去上清加入适量L-DMEM完全培养基,放入24孔板,置37℃,5%CO2培养箱培养.结果:培养3天后出现少量贴壁细胞,呈长梭形,10天后基本长满单层.细胞传代后增殖速度明显加快.结论:用酶消化法能分离得到真皮间充质干细胞.     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法：抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第二代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第二代MSC进行诱软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果：MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论：在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外可定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，可用于组织工程骨和软骨组织的修复和重建。     

诱导和非诱导骨髓基质干细胞在关节软骨缺损处成软骨的效应比较

目的:探讨经体外诱导和非诱导的骨髓基质干细胞复合胶原海绵修复兔膝关节全层软骨缺损成软骨效应的差异。方法:实验于2005-01/2006-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①将兔骨髓基质干细胞与载体胶原海绵共培养6h形成骨髓基质干细胞/胶原海绵复合物。②22只新西兰大白兔,分为两组。制备双膝股骨下端滑车的直径4.5mm、深3mm关节软骨缺损模型。未诱导组:一侧植入未经诱导的骨髓基质干细胞/胶原海绵复合物,作为实验侧;另一侧植入单纯胶原海绵,作为对照侧。诱导组:实验侧植入经软骨诱导的骨髓基质干细胞/胶原海绵复合物,对照侧为单纯胶原海绵。③术后未诱导组于0.5,1,2,3,5,7,9个月,诱导组于1,2,3,4,5,7个月分别处死动物,观察缺损修复情况及新生组织类型。参照Pineda标准对新生组织评分。结果:22只兔均进入结果分析:①两组兔材料移植后大体观察结果:未诱导组实验侧:移植后2个月,缺损修复处表面光滑,质地较硬,类似正常软骨,边界已不是很明显。至移植后7个月及9个月,修复组织与正常软骨基本相同。对照侧:移植后2个月,缺损处仍有较明显的凹陷,表面较粗糙,致密性差,质地较软,色泽与周围组织仍有较大差别。至移植后7个月及9个月,表面仍欠平整,质地仍欠坚韧,修复组织为白色纤维样组织,色泽与周围软骨组织仍尚有差别。诱导组大体观察情况与未诱导组相似,无明显差异。②两组兔软骨缺损区形态学观察结果:未诱导组:移植1个月,实验侧原软骨缺损区逐渐被透明软骨样组织取代,与周围软骨组织分界较明显,与周围软骨组织相比,细胞排列相对较不整齐,甲苯胺蓝染色阳性,随着时间的推移,与正常软骨组织结构相似,但并不完全一致。对照侧移植1个月以后未见明显修复,原软骨缺损区取代的主要是略带红色的纤维组织,界面明显,随着时间的推移,修复速度明显较慢,与周围软骨组织连接速度显著慢于实验侧,1个月时甲苯胺蓝染色呈阴性,3个月时呈弱阳性,5个月时异染仍不明显。③诱导组形态学观察情况与未诱导组相似,无明显差异。各阶段经改良Pineda评分的结果,未诱导组:实验侧平均评分低于对照侧(5.87±1.85,10.53±1.16,t=8.27,P<0.001);诱导组:实验侧平均评分低于对照侧(5.57±0.93,10.00±1.53,t=6.55,P<0.001)。结论:未经诱导的骨髓基质干细胞及经软骨诱导的骨髓基质干细胞移植后结果相似,提示软骨缺损处可提供诱导骨髓基质干细,胞的微环境。