整肠生对新型冠状病毒肺炎患者细胞因子水平和临床预后的影响

目的: 探讨整肠生（地衣芽孢杆菌活菌胶囊）改善新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease-19, COVID-19）患者高细胞因子水平和临床预后的效果,为临床开展肠道微生态疗法提供实验依据。方法: 回顾性分析2020年2月至3月武汉市同济医院中法新城院区收治的38例成年重症/危重症COVID 19患者,其中,18例患者接受了整肠生治疗（治疗组）,20例患者未接受整肠生治疗（对照组）。两组患者除接受常规治疗外,治疗组患者每天还服用整肠生以调节肠道微生态。记录两组患者临床基本特征,治疗前后白细胞、淋巴细胞及血小板计数,TNF-α、IL-1β、IL-6、PCT、CRP、ALT、白蛋白和肌酐水平,以及临床预后指标。结果： 治疗2周后,治疗组和对照组患者外周血中淋巴细胞计数明显高于治疗前（P<0.01）,血清C反应蛋白水平显著低于治疗前（P均<0.01）,但两组患者间淋巴细胞计数和C反应蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。经整肠生治疗2周后,治疗组患者血清中TNF α和IL-1β水平显著低于治疗前,并低于对照组（P<0.05）,但是两组患者的临床结局尚无显著差异（P>0.05）。结论： 整肠生可以降低COVID 19患者血清中TNF-α和IL-1β水平,但尚未观察到患者临床结局的显著改善。     

鲍曼不动杆菌OmpA经ROS/NLRP3信号通路调控THP 1细胞自噬和凋亡

目的: 探讨鲍曼不动杆菌外膜蛋白A(outer membrance protein A, OmpA)对人单核巨噬THP-1细胞自噬和凋亡的影响及其可能机制。方法: 构建OmpA/pET-28a载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3)表达纯化重组OmpA蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体;采用蛋白质印迹法检测呼吸机相关性肺炎患者发病前后血清中OmpA抗体水平变化。以不同浓度(1、10 μg/mL)重组OmpA蛋白分别刺激THP-1细胞1、3、6 h,采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1表达,流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧产生,荧光实时定量PCR检测细胞含NLR家族Pyrin域NOD样受体家族3(NLRP3)、Caspase-1和IL-1β等mRNA表达。结果： 自制多抗可以识别临床菌株OmpA蛋白。呼吸机相关性肺炎患者发病前后,血清中均可检出OmpA抗体(IgG型),且发病后OmpA抗体水平显著高于气管插管前(P<0.05)。重组OmpA蛋白刺激THP-1细胞后,细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著上升,细胞凋亡率显著升高,呈一定的时间和浓度依赖性(P<0.05)。与对照组比,在重组OmpA蛋白作用1 h时,细胞IL-1β mRNA表达和活性氧含量显著增加(P<0.05);3 h和6 h时,3种mRNA表达量和活性氧含量显著降低(P<0.05)。结论： OmpA通过激活THP-1细胞NLRP3炎症小体,释放活性氧和IL-1β等炎症介质,诱导THP-1细胞自噬和凋亡发生。     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

鲍曼不动杆菌荚膜厚度对鼠巨噬细胞炎症复合体活化的影响

目的: 探讨荚膜厚度不同的鲍曼不动杆菌激活鼠巨噬细胞Raw 264.7炎症复合体能力的差异。方法: 采用刚果红染色法观察鲍曼不动杆菌荚膜,筛选出荚膜厚度差异显著的两株菌株。将两株菌分别感染Raw 264.7,以实时定量 PCR法分析感染6 h的细胞NOD样受体家族3(NOD like receptors, NLRP3)、Caspase 1和IL 1β基因表达量;流式细胞术分析感染1、3和6 h的细胞活性氧表达量。结果： 刚果红染色可以清晰地观察到鲍曼不动杆菌周围一圈不着色的荚膜,选择出荚膜厚度差异显著的两株鲍曼不动杆菌用于感染细胞。不同荚膜厚度的鲍曼不动杆菌感染均可刺激Raw 264.7细胞NLRP3、Caspase 1和IL 1β mRNA表达上调,其中厚荚膜菌株诱导细胞NLRP3和IL 1β mRNA表达能力显著高于薄荚膜菌株（P<0.05）;不同荚膜厚度的鲍曼不动杆菌感染3 h和6 h时,细胞活性氧表达量均显著高于对照组(P<0.05),且厚荚膜菌株诱导活性氧表达能力显著高于薄荚膜菌株（P<0.05）。 结论： 不同荚膜厚度的鲍曼不动杆菌活化鼠巨噬细胞炎症复合体能力存在差异,厚荚膜菌株诱导炎症复合体活化的能力更强。