PCR AMPLIFICATION, MOLECULAR CLONING,DNA SEQUENCE ANALYSIS AND IMMUNO/PROTECTION IN BALB/C MICE OF THE 33 kDa ENDOFLAGELLAR PROTEIN OF L.INTERRORGANS SEROVAR LAI

INTRODUCTIONImmunizationwithinactivatedwhole-cellvaccine(WCV)were,andare,usedmainlyasameansofpre-ventingoutbreaksofleptospirosis.Howevertheirnmu-nityfollowingvaccinationwithtwodosesofWCVisofloworder,thedurationofimmunityconferredbyWCVisrathershort,sixmonthsoratmostoneyear.WCVhastheproblemofrequiringamixtureofvariousserotypestomakethevaccineeffectiveinthepreventionofleptospirosiscausedbythenumerousserotypes.Thus,researchhasfocusedonidentifyingprotectiveantigensforuseinarecombinantvacci…     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因与质粒DNA表达载体中CpG特定核苷酸序列及其在DNA疫苗中的作用

目的对赖型钩体DNA疫苗包括内鞭毛蛋白基因和质粒DNA表达载体的CpG特定结构进行分析,为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础.方法以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原,对内鞭毛蛋白基因(flaB2)及质粒DNA表达载体(VR1012)全核苷酸序列进行计算机分析.以flaB2与VR1012构建重组DNA进行NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验.结果flaB2共846bp,G+C%为47.9%;赖型钩体全基因组G+C%为36.8%,内鞭毛的G+C%比基因组高;CG特定核苷酸序列共51个,平均16.59%个bp有1个;flaB2中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共3个,分别为GACGCT1个,GACGTC1个,GACGCC1个;质粒DNA表达载体VR1012共4914bp,G+C%为49.4%,CG特定核苷酸序列共250个,平均19.66个bp有1个,VR1012中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共16个,分别为GACGTC5个,GACGCT2个,GACGCC1个,GACGTT1个,GGCGTT2个,GGCGCT2个,GGCGCC1个,AACGCT1个,AACGCC1个和特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个,位于5′端456-463;509-516;592-599;778-785,486-493;4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5′端且相对集中.TCG分散共53个,TCGTCG共1个,位于1873-1878,NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验的结果表明,加强注射接种后3周"VR1012+flaB2”组动物抗体效价增高(16倍),试验组存活率为90%.结论研究结果表明赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因及其质粒DNA表达载体构成的DNA疫苗具有明显的免疫原性和免疫保护作用,经DNA分析表明DNA疫苗中特别是质粒表达载体含有TGACGTCA等特定结构,是提高DNA疫苗免疫效能,减少疫苗免疫接种剂量一种行之有效的措施.     

问号赖型钩体重组质粒pDJH_2 DNA 序列测定及其与其它细菌omp基因序列比较分析

对ｐＤＪＨ２片段ＤＮＡ进行了序列测定，结果：插入片段为１８１１个核苷酸；可读框２个：ＯＲＦ１，１－５６５ｂｐ；ＯＲＦ２（从最后一个密码倒算）１－６６２ｂｐ，计算机序列同源性或类似性匹配（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）表明，ＯＲＦ１与ＯＲＦ２的核苷酸类似性为４９．３６％；ＯＲＦ１与Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ（Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ）流感伤寒型ｏｍｐ核苷酸序列类似性为４９．２６％；ＯＲＦ２与Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ类似性为５１．５６％；ＯＲＦ１与其它细菌（包括螺旋体）ｏｍｐ核苷酸序列对准比较，序列类似性均在４３％以上。经查阅ＥＭＢＬＤＮＡ序列数据库未见类似序列。作者认为ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ插入ＤＮＡ片段（ＯＲＦ１与ＯＲＦ２）可能是具有保护作用的ｏｍｐ基因片段。     

聚合酶链反应检测175例早期钩端螺旋体病患者血清钩体DNA的研究

作者设计并合成了钩端螺旋体(简称钩体)犬群大型Moulton株23S rRNA基因的一对引物,即引物A_1 5'GAT CTA ATT CGC TGT AGC AGG~3'及引物B_1 5'ACT TTC ACCCTC TAT GGT CGG~3'用于聚合酶链反应(PCR)检测不同群型的问号状钩体,结果该引物不能使双曲钩体、细螺旋体和其它致病微生物及人白细胞DNA等扩增特异性片段,并用该对引物扩增早期钩体病患者和正常人及其它疾病患者的血清标本(以临床确诊、血培养及MAT阳性为金标准),检测结果表明:PCR诊断钩体病的敏感性为92.00％,特异性为94.35％,准确性为92.54％,阳性预测值为98.17％,阴性预测值为78.13％,阳性拟然比为16.25,阴性拟然比为0.0848。由此表明PCR扩增钩体235 rRNA基因,是早期钩体病诊断的一种敏感、特异、快速而简便的方法。     

兔中性粒细胞抗菌肽的纯化和鉴定

作者用0.01 mol/L柠檬酸提取家兔中性粒细胞溶酶体可溶性成份,经制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从提取物中纯化出5种肽(NP_1、NP_2、NP_3、NP_4、NP_5),它们的分子量在2500～6000之间,体外杀白色念珠菌试验证实,NP_1、NP_2有高效杀菌活性,NP_3也有较强的杀菌活性。     

豚鼠黄疸出血型钩端螺旋体病肝微胆管及紧密连接的电镜研究

作者用冷冻复型及扫描电镜研究了钩体病黄疸豚鼠模型的肝脏。黄疸发生时,大量钩端螺旋体粘附于肝细胞血窦面、穿行肝细胞内或之间,甚至进入微胆管。肝细胞紧密连接的条索断裂,数量减少以至消失。微胆管内微绒毛减少,变形,管腔扩大,分支明显,并与Disse间隙沟通。肝间隙连接及其他膜性结构未见明显改变。     

“生物导弹”(或免疫毒素)研究进展

被称为八十年代“生物导弹”的MCAb-RTA已越来越广泛地在当今世界受到广泛关注,并取得了初步的成果。它将成为人们梦寐以求的抗癌治癌的有力手段。因而,对“生物导弹”(或免疫毒素)研究进展讨论是十分必要的。     

PCR扩增52株钩体23S rRNA基因及其临床应用55例分析

采用犬型钩端螺旋体(以下简称钩体)Moulton株23SrRNA基因273-293位点和376—396位点的引物A和B,即5＇GATCTAATTCGCTGTAGCAGG~(3＇)及~(5＇)ACTTTCACCCTCTAT-GGTCGG~(3＇),对52株钩体进行PCR扩增。结果表明49型50株问号状钩体均发生特异性扩增,而双曲钩体patoc型PatocⅠ株及细螺旋illini型3055株钩体不出现特异性扩增。用引物A和B对1992年从井研、西昌两地收集的早期钩体病患者的早晚期血清进行PCR扩增,结果第一次血清55份(发病后1～5天),PCR阳性51例(92.72％),第二次血清55份(发病后6～60天),PCR阳性41例(74.55％)。由此表明PCR不仅可广泛用于钩体病的临床早期诊断,而且可用于检测不同病程患者血中钩体DNA。     

氢化考的松预防钩端螺旋体病患者赫氏反应的研充

氢考组45例,予首剂青霉素40万U肌注,同时静滴氢考200mg, 1小时滴完,继以青霉素80万U肌注,q8h,氢考300mg静滴,3小时滴完。对照组52例以同样方法、剂量给青霉素,氢孝以安慰剂(VitC1.0g)静滴代替。结果氢考组45例,7例出现赫氏反应(16％),对照组52例中22例发生赫氏反应(42％)。两组比较有非常显著性差异(P<0.01)。观察中未发现有肾上腺皮质激素的副作用。