SOKT_1-RTA免疫毒素的制备及其对人T淋巴细胞的特异性细胞毒作用

抗人外周血T淋巴细胞单克隆抗体(McAb)SOKT_1通过SPDP与蓖麻蛋白A链(RTA)交联制成免毒素SOKT_1-RTA,在20mmol/L氯化铵存在条件下,能够杀伤82%人外周血T细胞,并使其~3H-亮氨酸掺入下降为对照的6.2%。SOKT_1-RTA的作用能够被未结合RTA的SOKT_1部分阻滞,而另一无关McAb末显示阻滞作用。表明:SOKT_1-RTA结合物具有SOKT_1的抗原结合特异性和RTA的细胞毒性,有可能成为清除人骨髓中T细胞的有效制剂。     

钩端螺旋体与体内细胞粘附的冷冻复型电镜观察

作者用冷冻复型等电镜技术观察了钩体病豚鼠肝内钩体与组织细胞间的相互关系。钩体以一端与细胞膜粘附,交界膜间界限清晰,内有质地不同于细胞外液的物质,称之为介质。钩体其他部位虽可与细胞膜紧靠,但两膜间无类似介质。介质的本质有待探讨。     

钩端螺旋体病人血清抗体的SPA-ELISA检测法

用酶标葡萄球菌A 蛋白作ELISA 检测临床确诊、显凝试验为阳性的钩端螺旋体病人血清59份,同时用40份健康人血清与酶标抗体作ELISA进行比较。两种方法都有较高的敏感性和特异性,而酶标葡萄球菌A 蛋白具有制备简单,标记步骤简便,比较稳定和易被推广等优点,可替代酶标抗体在ELISA中应用。     

浓缩和普通三价钩端螺旋体菌苗近期免疫效果的观察

我们于1983年5月至1984年2月在四川省平昌、仁寿和眉山县的15个公社133个大队,对成都生物制品研究所生产的浓缩和普通三价钩体菌苗进行了人体接种反应观察,血清抗体动态测定和流行病学近期效果考核。材料与方法     

赖型钩体重组质粒及表达保护性抗原,p68的研究

目的　寻找钩体病基因工程疫苗保护性抗原候选。方法　 （１） 鸟枪法构建赖型钩体０１７ 株基因库; （２） α互补、 Ｄ Ｎ Ａ 原位杂交筛选重组质粒; （３） Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交行 Ｄ Ｎ Ａ 同源性分析; （４） 双脱氧链中止测重组 Ｄ Ｎ Ａ 序列及与外膜蛋白基因 （ｏｍｐ） 匹配; （５） Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导重组子表达; （６） 免疫印迹、 Ｍ Ａ Ｔ、 Ｅ Ｉ Ａ、 Ｍ Ｔ Ｔ 检测表达蛋白抗原特性及 Ｉ Ｌ—２ 、 Ｉ Ｌ—６ 活性; （７） 纯化表达蛋白ｐ６８ 进行豚鼠主动免疫 攻击实验, 观免疫保护性。结果　 （１） 重组质粒ｐ Ｄ Ｊ Ｈ２ （ 亚克隆ｐ Ｄ Ｊｔ） 插入片段１９ｋｂ , 与各致病钩体不同片段 Ｄ Ｎ Ａ 高度同源; （２） 序列测定插入片段实际１８１１ｂｐ , 推测有２ 个读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 各有启动子、终止密码。查 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｅ Ｍ Ｂ Ｌ 无类似序列; （３） 表达蛋白分子量６８ｋ Ｄ （ｐ６８） ; （４） ｐ６８ 是胸腺依赖性 （ Ｔ Ｄ） 抗原,有良好抗原特性, 抗血清效价１ ： ５２４２８８ , （ Ｅ Ｉ Ａ） 具很强的动物免疫保护作用。结论　 （１） ｐ６８ 编码基因是致病钩体保护性抗原基因; （２） ｐ６８ 是致病钩体外膜保护性抗原,     

重组钩体基因疫苗免疫豚鼠脾细胞 LTT，IL-2，IL-6的活性测定

目的为从多方面证实赖型钩体重组基因疫苗的免疫活性。方法将赖型钩体重组基因多肽疫苗(分子量68kDa)多点皮下注射免疫豚鼠。(以质粒载体pT7-7为阴性对照,全钩死疫苗WCV为阳性对照)取其脾细胞,用3H-TdR法和MTT比色法分别测定特异性淋巴细胞转化试验(LTT)的相对转化指数(RPI)及IL-2,IL-6活性。结果1)重组基因疫苗免疫组特异性LTT的RPI为2.19±0.18明显高于pT7-7阴性对照1.42±0.27(P＜0.005),与阳性对照WCV无统计学差异(P＞0.05)。2)基因疫苗免疫组IL-2,IL-6活性分别为34.8±3.11,94.6±6.02测定值明显高于pT7-7阴性对照20.4±3.05,61±6.28(P＜0.005),与WCV阳性对照无统计学差异(P＞0.05)。结论1)钩体基因重组疫苗能使免疫豚鼠体内Th1、Th2活化增强,有胸腺依赖性抗原性质(TDAg),可激起体内强有力T-B细胞协同效应的特异性体液免疫反应,确有增强免疫活性作用,是良好的免疫原。2)重组钩体基因疫苗与阳性对照WCV各实验值无统计学差异,提示二者免疫活动可能相当,但重组基因疫苗有毒副作用小的优势,应用前景良好。     

问号赖型钩体内鞭毛基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌的表达

为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，利用聚合酶链反应扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经ＳａｌⅠ、ＣｌａⅠ双酶切消化后定向克隆于ｐＴ７－７表达载体上。重组质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示此产物相对分子量为３４ｋｄ，产量占细菌总蛋白的１１．８％。用插入片段为探针，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交提示可能有两个相关的基因存在于钩体的基因组内。Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交证实该表达蛋白可与内鞭毛抗血清在３４ｋｄ处出现印迹，与钩体内鞭毛同类蛋白带位置一致，本实验克隆了钩体内鞭毛Ｂ类基因并表达了相应抗原。     

钩端螺旋体外膜免疫生物学特性的研究

作者采用改良钩体外腹提取法,提取五株钩体外膜均获成功。电镜观察发现五株钩体外膜超微结构层数存在明显差别。豚鼠保护力试验证实赖型017株外膜对同型强毒株攻击具有明显的保护作用。SDS-PAGE和免疫印迹分析表明017株外膜蛋白具有良好的抗原性。017株和601株外膜蛋白电泳图谱及兔抗血清交叉识别图谱虽非常相似,但存在明显差别。     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建

目的为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpGmotifs,因而可发挥佐剂作用.方法提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果经酶切鉴定证实有一1.8kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8kb可被酶切为9.6kb及8.5kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实P1、P2引物扩增出9.6kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫？…

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８例的免疫保护作用，采用随机、以盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质