壳聚糖酶的纯化、基因克隆、及其酶学特性的鉴定

从被污染的酵母培养液中分离到-菌株,经鉴定为一种革兰氏阳性杆菌,其所分泌的主要蛋白产物经纯化后,测定了它的N-端氨基酸序列,与已知的几种内切壳聚糖酶十分类同.根据其同源DNA序列,通过PCR方法克隆了其全长基因.该菌株生长极快,其组成型分泌产物主要为内切壳聚糖酶.该酶通过疏水层析和分子筛两步即得到纯化.进一步研究了该酶的酶学性质及其催化壳聚糖降解为壳寡糖的条件.提高该壳聚糖酶的产率后,有望用于壳寡糖的生产,有实际应用价值.     

淅江蝮蛇毒舒缓激肽增强肽结构与功能的研究

取浙江蝮蛇(Agistrodon halys Pal-las)毒液的冷冻干粉,用70％甲醇抽提,提取液在Sephadex G—15层析柱上分离出三个舒缓激肽增强肽(Bradykinin Po-tentiating Peptide,BPP)组分。对其中BPP,组分,先后用外肽酶水解及层析等步骤提纯,以焦谷氨肽酶去除N-末端的焦谷氨酸后,采用微量Edman有色试剂(DAB-ITC—Edman降解)测定氨基酸顺序,测得BPP_1结构为:Glu·Gly·Arg·Pro·Pro·Gly·Pro·Pro·Ile·Pro·Pro     

微生物产生的酶抑制剂研究 Ⅵ.S-038菌株产生的抑胃酶剂提取纯化和鉴别

S-038抑胃酶剂是福东链霉菌S-038菌株产生的。经正丁醇萃取、硅胶柱层析分离得到并经过DEAE-52纤维素和Sephedex G-15层析纯化。通过理化性质、紫外光谱、红外光谱、氨基酸分析,高压液相色谱以及质谱等的研究,认为其主要组分与Pepstatin A同质。     

胰酶和激肽释放酶分离的初步研究

<正> 胰酶应基本上含有动物胰脏中存在的各种酶类,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和核酸酶等。胰酶中的蛋白酶类属内肽酶的包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和激肽释放酶等。这些内肽酶皆系丝氨酸蛋白酶。属外肽酶的主要是羧肽酶A和B。猪胰激肽释放酶在日本脏器生化药物中其年产值居于首位,临床已用于治疗初老期循环     

人脑源性神经营养因子基因的定点突变

应用寡核苷酸诱导的定点突变和ＰＣＲ技术对人脑源性神经营养因子基因进行突变，并完成了测序鉴定。为今后对脑源性神经营养因子结构与功能的研究奠定了基础     

逆转录病毒载体介导骨髓基质细胞体外表达人凝血因子Ⅷ

目的探索骨髓基质细胞用于血友病A基因治疗的可能性.方法采用一包含了B区缺失(△760aa～1?639aa)的人凝血因子ⅧcDNA(FⅧ△BcDNA)的复制缺陷型重组逆转录病毒LNC-FⅧ△B,在低温(32?℃)和离心等改进条件下转化体外分离培养的小鼠和兔骨髓基质细胞.分别采用一期法、ELISA法和半定量PCR方法检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧC)和抗原含量(FⅧAg)以及骨髓基质细胞的基因转化效率.并对转化细胞表达的FⅧ蛋白进行Westernblot分析.结果与标准方法相比,离心和32℃转化使小鼠骨髓基质细胞的基因转染效率提高50%～80%.转化后的小鼠和兔骨髓基质细胞分泌的人FⅧAg分别为每24h(556±80)ng/106细胞和每24h(480±56)?ng/106细胞,FⅧC分别为每24?h2.42?U/106细胞和1.8U/106细胞.Westernblot分析显示,骨髓基质细胞分泌缺失B区的FⅧ蛋白(FⅧ△760～1639aa)与正常人血浆中的野生型FⅧ相似,主要以重-轻链异二聚体形式存在.结论转化后的骨髓基质细胞可以高效分泌人FⅧ,结合离心和低温对方法的改进,可望成为血友病A基因治疗研究的良好靶细胞.     

猪胰羧肽酶A和B的分离与纯化

<正> 哺乳动物的胰脏富含羧肽酶原,经胰蛋白酶激活后形成活性酶,羧肽酶是一类专一性水解多肽或蛋白质C-端的重要蛋白水解酶。羧肽酶A主要水解由芳香族氨基酸为游离C-端的肽键;羧肽酶B主要水解由碱性氨基酸为游离C-端的肽键。至今羧肽酶A的研究已较为深入,其氨基酸组成、一级结构与空间构象均已基本搞清。Anson在1937年已结晶了羧肽酶A。最近本文作者在猪胰蛋白水解酶综合利用的过程中分离、纯化了羧肽酶A和B,并使之固相化。本文对此工作作一报道。     

精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达，将含有人FⅧBD（B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBDl转染至小鼠精子，通过人工授精使母鼠受孕，新生小鼠出生后第4周，应用PCR筛查hFⅧBDcDNA阳性转基因幼鼠，取转有人FⅧBDcDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体，分别用Northern印迹和Western印迹检测脾，肝，肺和肾组织中人FⅧBDcDNA的转录和表达。结果发现，人工授精后20只受体母鼠7只受孕，共产下11只仔鼠，存活9只，PCR筛检出3只转有人FⅧBDcDNA的阳性鼠，3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65ng/ml,7.84ng/ml和8.44ng/ml，人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾，肝，肺和肾组织中均有人FⅧBDcDNA的转录和表达。结论提示，利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠，并表达人FⅧ蛋白，这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。     

Antagonistic effect of orphanin FQ on opioid analgesia in rat

目的：研究孤啡肽（ＯＦＱ）对痛与阿片镇痛的影响．方法：脑室（ｉｃｖ）与鞘内（ｉｔｈ）给药，以大鼠甩尾模型测痛．结果：小剂量ＯＦＱ（０１μｇ）ｉｃｖ及ｉｔｈ给药对痛反应均无影响；较大剂量ＯＦＱ（０５－１０μｇ）可使痛反应增强．ＯＦＱ１－１０（ＯＦＱ的一个片段）ｉｃｖ对痛反应无影响．μ受体激动剂芬太尼（１μｇ）、δ激动剂ＤＳＬＥＴ（５μｇ）ｉｃｖ或ｉｔｈ给药，以及κ激动剂Ｕ５０４８８Ｈ（１μｇ）ｉｔｈ给药，可使痛阈明显增加．０１μｇ或１μｇＯＦＱ与上述药物合用后，痛阈增加明显减少（除鞘内与ＤＳＬＥＴ合用外）．结论：ＯＦＱ可增强大鼠的痛反应，在脑内对抗由μ和δ受体介导的阿片镇痛，在脊髓对抗由κ和μ但不是由δ受体介导的镇痛．     

牛碱性成纤维细胞生长因子在酵母中表达产物的纯化与鉴定

在以往工作基础上，将已经鉴定的牛碱性成纤维细胞生长因子（ｂｂＦＧＦ）基因克隆至酵母分泌型表达载体ｐＶＴ１０２Ｕ／α，并转化宿主菌Ｓ－７８。表达产物经一系列纯化后，得到ＳＯＳ－ＰＡＧＥ银染鉴定纯度＞９０％的最终产物，免疫学和细胞学检测结果表明，重组ｂｂＦＧＦ具有与天然ｂｂＦＧＦ相同的生物活性。