日本血吸虫新基因精氨酸酶的扩增及序列分析

目的获取并真核克隆日本血吸虫新基因精氨酸酶全长cDNA.方法对本实验室曾获得精氨酸酶基因利用生物信息学进行分析,发现其5'端尚缺一段序列;根据已知序列设计引物,用5'端单巢式PCR从尾蚴文库中扩增,以获得精氨酸酶基因完整的阅读框(ORF);用生物信息学技术对获得的精氨酸酶编码基因进行结构与功能的分析;并将新基因的完整编码阅读框克隆入真核表达载体pCDNA3.1.结果用5'端单巢式PCR从尾蚴文库中获得了精氨酸酶5'端所缺序列,得到其完整的ORF,其ORF长1 095 bp,编码364个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫精氨酸酶的完整cDNA序列.重组质粒经双酶切DCR及测序鉴定证明日本血吸虫精氨酸酶真核表达质粒构建成功.结论成功获得、识别、扩增并克隆日本血吸虫精氨酸酶编码基因的全长cDNA.     

茜根汤治疗肝炎肝纤维化的临床观察

目的:观察茜根汤治疗肝炎肝纤维化的疗效.方法:治疗组49例采用茜根汤治疗,对照组48例采用复方丹参片治疗.结果:治疗组在改善临床症状及肝功能、肝纤维化指标方面均优于对照组(P<0.05).结论:茜根汤治疗肝炎肝纤维化的疗效较好.     

恶性疟原虫热休克蛋白86(HSP86)基因置换型和插入型打靶载体的构建

目的 对恶性疟原虫热休克蛋白基因进行体外扩增,构建ＨＳＰ８６基因打靶载体,利用基因敲除技术进行恶性疟原虫热休克蛋白基因功能的研究。方法 恶性疟原虫体外培养,基因组ＤＮＡ提取,目的基因扩增,载体与目的片段连接、阳性克隆筛选及酶切鉴定。结果 经酶切鉴定ＰＣＲ产物及插入片段大小与预期值相符,进一步测序鉴定证实ＰＣＲ产物及插入片段为所需目的基因片段。插入片段经酶切鉴定证实插入方向正确。结论 成功构建了用于     

恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达

目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＨＲＰⅡ全编码区基因,经ＨｉｎｄⅢ和Ｂａｍ ＨＩ双酶切后定向克隆入带ＣＭＶ启动子的真核高效表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＨＲＰⅡ／ｐｃＤＮＡ３重组载体;用脂质体法将重组载体转染ＨｅｐＧ２肝癌细胞,经Ｇ４１８加压筛选后,收集阳性克隆细胞培养上清,表达产物进     

重组日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）酶学特性的研究

目的获得重组SjLDH主要的酶动力学参数。方法分光光度计测定NADH在340nm处吸光度的变化，检测不同pH及温度下重组蛋白催化正、逆反应的效率以确定其最佳pH、最佳温度；分别固定底物NADH、丙酮酸、NAD＋及乳酸浓度，分别测定丙酮酸、NADH、乳酸及NAD^＋在不同浓度下的反应速度，计算机Lineweaver-Burk双倒数方程回归计算各底物的米氏常数（Km值）、最大反应速度（Vmax）。并比较各自的Vmax／Km值。结果重组蛋白酶活性为379U／mg。催化正、逆反应的最佳pH分别为pH6．0—7．0和pH9．0—10．0；催化正、逆反应的最佳温度分别为37—60℃及40—50℃，后者在70℃时仍有较高催化活性；在NADH辅酶作用下，重组SjLDH催化丙酮酸还原为乳酸的最大反应速度是催化NAD＋作用下乳酸氧化为丙酮酸的21倍。比较丙酮酸与乳酸的Vmax／Km值。前者是后者的23倍。而NADH的Vmax／Km值是NAD＋的7倍。结论重组蛋白在生理条件下主要催化丙酮酸还原为乳酸的反应。     

生物信息学分析亚洲牛带绦虫WD40基因及其蛋白质的结构与功能

目的 分析和预测亚洲牛带绦虫WD40基因及其编码蛋白的结构和特性，用于指导其生物学功能的实验研究。方法 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY，http：／／ca．expasy．org／）和IEDBAnalysisRecource提供的各种生物信息学在线分析程序，结合其它生物信息学分析软件包如Pcgene和VectorNTIsuite，从亚洲牛带绦虫全长cDNA质粒文库中识别WIMO基因及其编码区，分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。结果 该基因全长1208bp，编码区为81～1056bp，编码402个氨基酸，为全长基因；无跨膜区，具有多个磷酸化位点，蛋白的理化性质稳定，理论分子量为35942．4；没有质体、线粒体定位序列；预测该蛋白表面有三个亲水性强的线性表位和三个B细胞抗原表位。结论 应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫WD40基因，并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行了预测。     

影响外源DNA导入哺乳动物细胞有关因素的研究

本文采用磷酸钙-DNA共沉淀转化法将多种重组质粒导入Hela细胞，并对影响其转化效率的有关因素进行了观察，建立了适合本实验室的标准化转染方法。结果表明：1)待转化的细胞应为单层约稀疏的对效生长期细胞；2)重组质粒DNA的浓度为8～10μg/100ml培养瓶；3)磷酸钙-DNA共沉物与持转化的细胞共孵育时间为10h；4)G418是在转染后24h加入，浓度为200μg/ml，为最佳转化条件。本研究采用该方法将质粒pcDNA3，pcDNA3-MSP119，pcDNA3-SjESG，pcDNA3-CSP，pcDNA3-MSP1，pcDNA3-MSP2和pcDNA3-Pfs48/45导入哺乳动物细胞HaLa细胞均获得满意结果。每微壳DNA的平均克隆数高达9．6。重组质粒DNA导入哺乳动物细胞方法的标准化为外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达创造有利条件。     

SAG3基因在造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断中的应用

目的探讨造血干细胞移植患者弓形虫感染的快速、特异、敏感的诊断方法。方法以弓形虫SAG3基因为靶基因，采用聚合酶链反应法(PCR)对56例造血干细胞移植受者及20名正常对照者进行检测，同时以酶联免疫吸附试验(ELISA)进行弓形虫抗体IgG、IgM的血清学检测。结果以PCR和ELISA检测弓形虫SAG3基因片段和其抗原，阳性分别为10例及7例，阳性率分别为17．9％和12．5％，其中PCR检测阳性、而ELISA检测阴性的3例，经病原学检测，均证实有弓形虫感染；20名正常对照者的检测结果均为阴性。结论体外扩增弓形虫SAG3基因的方法诊断弓形虫感染具有准确、快速、特异和敏感的优点，可作为造血干细胞移植患者弓形虫感染的诊断方法之一。     

弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

目的：分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法：在5′端和3′端引物分别引入EcoRI和SpeI酶切位点，PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因，定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中，构建不带6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacI酶切下表达盒，氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16，通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子，并利用MM／MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母，用甲醇诱导表达，并分析SAG1的表达水平，从中筛选高表达转化子。结果：获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第3天，细胞裂解液SDS－PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带，但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少，而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有40kDa和27kDa的两种蛋白，后的量大于前，并与SAG1成熟肽的大小一致，PMD16株的表达量大于PMD11株，总蛋白量约35μg/ml。结论：弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达，但PMD11宿主菌会降解外源蛋白，而缺失了蛋白酶的PMD16宿主菌能比较高效地表达、分泌SAG1成熟蛋白。     

包虫疫苗候选抗原基因FABP的克隆与序列分析

目的 获得细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白（FABP）基因序列资料，并进行序列分析。方法 从包虫包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴（protocloex)，提取RNA和DNA，分别以cDNA和基因组DNA为模板扩增出FABP基因；并将其分别克隆到T载体后进行序列测定和分析；同时将从cDNA扩增得到的FABP基因亚克隆到原核表达载体（pTGEX-4T)。结果 获得长度分别为402bp和482bp两个FABP基因，序列分析表明内含子区域在349…427bp，同源性比较结果FABP基因ORF内一个碱基突变。结论 获得了FABP基因，为研究其免疫效果奠定了基础。