运动与骨骼肌细胞信号转导机制的研究进展

细胞通过位于胞膜或胞内的受体,感受细胞外信息分子的刺激,经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能,这一过程称为细胞信号转导.     

MIP4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制

目的：为研究MIP4（巨噬细胞炎性蛋白4）的突变体在拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用中的活性。构建MIP4突变体（Met-MIP4)并进行原核表达和纯化，体外观察其拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用。方法：将Met-MIP4基因片段插入到pR-SET-A融合表达载体中。诱导表达后，表达工程菌经超声裂菌后鉴定可溶性，细菌裂解上清经镍螯合亲和层析纯化，采用葡聚糖沉淀法分离和纯化嗜酸粒细胞，利用24孔Transwell双层板鉴定融合表达蛋白的趋化和抗趋化活性。结果：构建入融合表达载体pRSETA的基因在大肠杆菌中得到表达。裂菌后鉴定显示融合蛋白可溶部分占80%，经镍螯合亲和层析纯化后纯度达87%，分离的嗜酸粒细胞纯度达到90%，拮抗嗜酸粒细胞趋化活性实验表明，纯化的Met-MIP4蛋白具有明显拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用。结论：Met-MIP4突变体基因在pRSETA融合表达载体中获得可溶性表达和纯化，生物学活性实验表明融合的pRSET-Met-MIP4蛋白具有拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用的活性。为进一步开发其临床应用奠定了基础。     

MUC1在甲状腺癌及甲状腺良性病变组织中的表达及意义

目的检测多态性上皮粘蛋白 (polymorphicepithelialmucin ,PEM ,又名MUC1)在甲状腺癌及甲状腺良性病变组织 (结节性甲状腺肿 ,甲状腺腺瘤 )中的表达 ,探讨其在甲状腺癌诊断和免疫治疗中的意义。方法采用免疫组化方法检测 6 8例甲状腺癌及 18例甲状腺良性病变组织、10例甲状腺正常组织中MUC1的表达。结果甲状腺癌组织中MUC1阳性表达 5 1例 ,免疫组化染色表现为胞浆内深棕色或棕黄色颗粒 ;结节性甲状腺肿 ,甲状腺腺瘤MUC1阳性表达 4例 ,甲状腺滤泡上皮腺腔缘为黄色或棕黄色颗粒 ;正常甲状腺组织中阳性表达 1例。MUC1在甲状腺癌组织中的阳性表达率与甲状腺良性病变组织及甲状腺正常组织相比 ,差异有显著性 (χ2 =17 2 0 ,P <0 0 1)。MUC1在甲状腺癌组织中阳性表达与甲状腺癌的病理类型和颈淋巴结有无转移无关 (χ2 =0 72 ,P >0 0 5 )。结论MUC1在甲状腺癌组织中的表达及其分布特点可作为甲状腺癌的鉴别诊断指标。     

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒

背景：一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体，可提高转染和表达效率。目的：利用多形上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，MUC1）多肽骨架中含有许多连续重复系列，构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte macrophagehage colony stimulating factor，GM-CSF）基因重组的真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）．MUC1-GM-CSF，并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。设计、时间及地点：基因重组体设计实验，于2005—09，2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。材料：真核表达载体pcDNA3．1（＋）由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠，pGEM-3zf（-）-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E．coli DH5α为自备，雌性BALB／c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体，酶叨鉴定及序列分析后，与GM—CSF基因克隆入pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，构建真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）-MUC1-GM—CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。主要观察指标：通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明，重绍质粒含育人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因，在COS-7细胞中可检测到MUC1表达，重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM—CSF抗体。结论：成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM—CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。     

氯通道阻滞剂在β_(25-35)淀粉样多肽诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨氯通道阻滞剂(DIDS)对β25-35淀粉样多肽(Aβ25-35)诱导PC12细胞凋亡的影响。方法PC12细胞按实验不同分为对照组(DMEM培养液)、Aβ25-35组(Aβ25-35 40μmol/L)、DIDS组(Aβ25-35 40μmol/L+DIDS 50μmol/L)。MTT法测细胞存活率,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态学改变,流式细胞技术测细胞凋亡率。结果Aβ25-35组与对照组和DIDS组比较,PC12细胞的存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05),不同DIDS浓度依赖性升高PC12细胞存活率,DIDS 50μmol/L能显著下调Aβ25-35诱导的细胞凋亡(P<0.05)。结论DIDS对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤有保护作用。     

siRNA干扰Geminin基因对脑胶质瘤放疗敏感性的影响

目的 观察敲低Geminin对人脑胶质瘤细胞放疗敏感性的影响。方法 利用GEPIA和CGGA数据库分析Geminin在脑胶质瘤组织中的表达及与生存期的相关性。实验分为两组：si-GL2组(对照组)和si-Gem组(干扰组),设计siRNA干扰序列(si-Gem)和阴性对照序列(si-GL2),分别转染脑胶质瘤细胞LN229和U87,qRT-PCR和Western blot检测转染效率及蛋白表达水平。流式细胞术检测碘化丙啶(PI)染色后DNA含量分布，进而分析敲低Geminin对DNA再复制的影响。通过AnnexinⅤ-FITC/PI法，用流式细胞术检测敲低Geminin对细胞凋亡的影响。CCK-8细胞增殖实验检测敲低Geminin对胶质瘤细胞LN229和U87放疗敏感性的影响。Western blot检测Geminin相关分子Cdt1和DNA相关损伤蛋白γ-H2AX的表达水平。结果 脑胶质瘤组织中Geminin的表达水平高于癌旁正常组织，且Geminin表达越高，脑胶质瘤患者预后越差(P<0.05)。与si-GL2组相比，si-Gem组Geminin在LN229和U87细胞中的表...     

胸腺素α1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α     

TNFHis-IL-11温度诱导融合表达载体的构建

目的构建TNFHis IL 11温度诱导融合表达载体。方法用EcoRI和PstI消化pGEMIL 11质粒后 ,回收IL 11基因片段 ,以同样的酶切位点克隆入TNFHis表达载体。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α菌株 ,经 4 2℃温度诱导 4 .5h后做SDS PAGE和免疫活性鉴定。结果融合蛋白获得了表达 ,其分子量为 37kD ,其表达量占菌体总蛋白的 2 5 %。免疫印迹反应结果显示 ,表达的融合蛋白可与抗IL 11多克隆抗体产生阳性反应。该融合蛋白经盐酸羟胺裂解后可获得IL 11单体。结论TNFHis IL 11温度诱导融合表达载体构建成功。     

Effects of Novel recombination human tumor necrosis factor on tumor cell growth and NF-KB activity

Objective: To investigate the relationship among the TNFRp55 and TNFRp75 expression in tumor cell lines in vitro, the suppression of nrhTNF on the tumor cell lines growth and the changing of NF-kB activity in the tumor cell lines. Methods:The expressions of TNFRs are studied by immunohistochemistry. The inhibition of nrhTNF to tumor cells was investigate by crystal violet assay. The changing of activity of NF-icB was evaluated by using immunohistochemistry and Western blot methods. Results: In tumor cell lines, positive rates of expression of TNFRp55 and TNFRp75 were 99% and 98. 8% respectively. There was no significant difference among various types of tumor cells (P>0. 05). nrhTNF could inhibit the growth of SW480, SGC7901, 8910, SMMC7721 and BEL-7402 cell lines in which NF-icB translocated into cytonuclei slightly. However, nrhTNF has no effects on A549, PLA801, Hela, Ecal09 and GRC-1 cell lines in which NF-kB translocated into cytonuclei obviously. Conclusion: The low degree of activating of NF-kB m     

重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测

目的：利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β4（Tβ4）并对其进行纯化和鉴定．方法：使用大肠杆菌偏爱密码子合成人Tβ4全长基因，构建了Tβ4的二串联体基因（Tβ4②），将其克隆入表达载体pET-22b（＋）中，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，IPTG诱导表达后，经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白，采用免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋白进行鉴定．结果：获得了纯化的重组Tβ4②蛋白，并具有生物学活性．结论：成功构建、表达和纯化了Tβ4②，为其功能研究奠定基础．