重组人胸腺肽α1工程菌的高密度发酵

为实现重组人胸腺肽α１工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＴｈｉｏ Ｈｉｓ－Ｔα的高密度高表达发酵,首先进行了培养条件的摸索,确定了该工程菌的最佳培养条件、诱导剂ＩＰＴＧ的浓度、诱导起始和结束时间,然后用５Ｌ自控发酵罐进行分批补料培养,发酵中采用分阶段限制性流加氮、碳源,保持溶解氧在３５％左右,结果经３ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ,３批重复发酵,最终菌体密度均达到６０Ａ６００以上（相当于干菌２５．６ｇ／Ｌ）,保持了并超过了该重组蛋白在试管和摇瓶中的表达量,融合蛋白Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ－Ｔα的表达占菌体总蛋白的４２．４％左右,含量达到了５．７ｇ／Ｌ,相当于胸腺肽α１ ２．４ｇ／Ｌ,为胸腺肽α１的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

新型基因工程人肿瘤坏死因子-α的临床前研究

目的 研究一种新型基因工程人肿瘤坏死因子－α(nrhTNF-α)的临床前药理、毒理和药代动力学特性。方法 观察nrhTNF-α对动物移植性肿瘤的抑制作用、毒副作用（如急性中毒反应和死亡情况，过敏反应，以及对神经系统、呼吸系统、心血管系统、造血系统和免疫系统的影响）及药代动力学变化。结果 nrhTNF-α具有明显的抑瘤作用且呈剂量依赖性。对动物的急性中毒表现及病理变化与rhTNF-α相似，未见其他不良反应。结论 nrhTNF-α的抑瘤作用明显，毒副反应低，具有良好的临床应用前景。     

应用基因工程方法制备新型重组人肿瘤坏死因子-α

目的　应用基因工程技术 ,制备一种新型的重组人肿瘤坏死因子 α (novelrecombinanthumantumornecrosisfactor α ,nrhTNF α) ,并对其生物学活性、理化性质进行鉴定 ,为进入临床前研究提供基础。方法　应用PCR技术 ,将hTNF α基因的 5′端 17个氨基酸的编码序列删除 ,基因中Pro8Ser9Asp10 的编码序列用Arg Lys Arg的编码序列取代 ,同时Leu157的密码子被Phe的密码子所取代。将hTNF α突变基因 ,插入原核高效表达载体pBV2 2 0中 ,构建高表达工程菌株。纯化表达产物 ,对连续 3批制备的新型rhTNF α,按人用《重组DNA制品质量控制要点》检定要求进行鉴定。结果DNA序列分析和蛋白质N末端、C末端部分氨基酸序列分析表明 ,nrhTNF α与天然的hTNF α相比较 ,N末端缺失了 7个氨基酸 ,13位氨基酸为Arg Lys Arg ,其后为天然hTNF α 11位以后的氨基酸。 15 7位Leu的密码子被Phe的密码子所取代。产物表达量占菌体蛋白的 6 7.4 %。经 (NH4) 2 SO4沉淀、Q SepharoseF .F .及S SepharoseF .F .柱层析分离纯化后 ,产品的纯度达 99% ,比活性达 1× 10 9IU/mg蛋白。结论成功地制备了nrhTNF ,对连续 3批制备的nrhTNF α按人用《重组DNA制品质量控制要点》检定要求进行鉴定 ,所有项目均合格     

新型肿瘤坏死因子免疫抑制剂的克隆和表达

目的：用鸡卵清溶菌酶（hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换新型rhTNF—α3’末端序列，构建和表达新型rhTNF-α免疫抑制剂。方法：克隆、表达、纯化和鉴定新型rhTNF-α免疫抑制剂。结果：DNA测序表明，重组新型hTNF—αHEL的3’末端序列与设计序列完全相同。将其转移到pBV220表达载体中，重组菌经42℃诱导后做SDS—PACE分析，结果显示该重组体获得了表达，其表达量为菌体总蛋白量的30％，表达形式为包涵体，对该包涵体进行溶解和复性，再经阴离子交换柱纯化，获得的重组蛋白的纯度可达90％以上。免疫印迹鉴定结果证实，该表达蛋白可与抗TNF—α抗体产生免疫反应。体外杀伤活性检测显示，该蛋白已完全丧失了新型TNF—α的体外杀伤活性。结论：上述实验证实，新型rhTNF—α免疫抑制剂构建成功，该免疫抑制剂既保持了与TNF—α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性，为其下一步治疗作用的研究打下了基础。     

hTNFA-hPgnK5融合蛋白的原核表达及测定

目的　获得 h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因 ,在原核细胞中表达融合蛋白 ,探索其活性 .方法　 PCR法改造h TNFα基因 ,消除其终止密码子 ,构建 h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因 .在大肠杆菌 DH5α中表达该融合蛋白 ,测定其体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性 .结果　 h TNFα基因经 PCR法改造 ,去除了终止密码子 ,并在 3 端引入 Bam HI位点 .h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因构建完成 ,并在原核系统中获得表达 ,免疫印迹反应表明该融合蛋白具有 h Pgn K5免疫活性 .体外实验表明该融合蛋白可抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的增殖 .结论　 h Pgn K5蛋白可与 h TNFα一起表达 ,该融合蛋白有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性     

重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1（thymosin alpha 1,Tα1）的串联体并进行纯化、鉴定。方法 将Tα1的基因拆发为4个片段进行合成,退火后经PCR获得串联体基因,测序正确后克隆在硫氧还蛋白（thioredoxin)融合蛋白表达载体pThioHisA中,转化大肠杆菌TOP10菌株,IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经过80℃热处理及阴离子交换柱Q－Sepharose Fast Flow进行纯化,Western-blot进行鉴定。结果 获得了纯化的Thioredoxin-Tα1③,分子质量约为31ku。结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法,Tα1③的成功表达为检测其生物学活性奠定了基础。     

重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人PD-1IgV(rhPD-1IgV)蛋白.方法:人工合成PD-1IgV基因,并将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中.转化宿主细胞大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组融合rhPD-1IgV蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:rhPD-1IgV的Mr约为15×103,与根据其氨基酸组成计算的理论值一致.成功纯化了rhPD-1IgV蛋白,并对其进行了复性和浓缩,且复性后的蛋白可与其配体B7-H1结合,显示出良好的结合活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了rhPD-1IgV蛋白.     

MUC1基因疫苗和GM-CSF对小鼠的细胞免疫和体液免疫应答

目的:观察MUC1基因疫苗和GM-CSF共免疫对小鼠特异性细胞免疫和抗体水平的影响.方法:采用股四头肌肌肉注射,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫雌性Balb/c小鼠,每3 wk 1次,共3次.MUC1基因加GM-CSF组于每次基因免疫后1,3,5 d,皮下注射GM-CSF 100 μL.最后1次基因免疫后第3周接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞.2 wk后观察、记录肿瘤的生长情况.流式细胞仪检测外周血CD4 和CD8 淋巴细胞亚群的百分比和比值.ELISA方法检测小鼠血清MUC1特异性抗体的水平.4 h 51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性.结果:淋巴细胞亚群:与pcDNA3.1对照组相比,MUC1基因疫苗预防组的CD8 T淋巴细胞升高,差异有统计学意义(P《0.01),CD4 T淋巴细胞升高,差别无统计学意义;加GM-CSF佐剂预防组与单独MUC1疫苗预防组相比,CD4 T淋巴细胞升高,差异有统计学意义(P《0.01),CD8 T淋巴细胞升高差别无统计学意义.小鼠血清MUC1抗体水平:与对照组相比,MUC1基因疫苗预防组抗体水平升高,差异有统计学意义(P《0.05);加佐剂组与预防组相比,抗体水平升高但差别无统计学意义.在不同效靶比时, MUC1基因疫苗加GM-CSF组与单独MUC1基因免疫组相比较,特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率差异显著(P《0.05).结论:MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CD8 T淋巴细胞及体液免疫应答, GM-CSF对小鼠CD4 T淋巴细胞具有一定的调节作用.     

新型重组人肿瘤坏死因子工程菌的发酵工艺研究

目的研究并建立新型重组人肿瘤坏死因子 (nrhTNF)的发酵工艺。方法通过探讨nrhTNF工程菌在试管和锥形摇瓶中的生长和表达规律 ,筛选并确定其最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件 ,然后在 5L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果nrhTNF工程菌在 5L发酵罐中培养至终密度A60 0nm30左右时 ,目的蛋白的表达最高 ,保持在菌体总蛋白的 5 0 %附近 ,发酵时间为 12～ 13h。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为nrhTNF的工业化生产奠定了基础。