常压色谱分离纯化重组人白细胞介素2

作采用７ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍直接裂解重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ－２）工程菌，溶解包含体蛋白，利用硫水色谱、凝胶过滤、离子交换分离纯化ｒｈＩＬ－２，各步收率分别为１４０％，８５％，７０％。终产品比活性为１．９×１０＾６Ｕ／ｍｇ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为单一条带，得到高比活高纯度的ｒｈＩＬ－２。本方法利用疏水色谱既能分离又能促进ｒｈＩＬ－２复性的特点，克服了包含体蛋白较难溶解双易聚合的缺点，提出了ｒｈ     

融合蛋白IFN-α2b-NGR 在荷瘤小鼠体内的肿瘤局部分布及组织定位

目的:研究融合蛋白IFN-α2b-NGR在荷瘤小鼠不同组织中的分布. 方法:接种小鼠多发性骨髓瘤细胞株SP2/0于小鼠腋窝皮下,待肿瘤模型建立后,经小鼠尾静脉注射IFN-α2b-NGR,IFN-α2b和生理盐水,30 min后取小鼠血清及组织匀浆上清. 用ELISA方法检测血清和组织上清中的IFN-α浓度,免疫组化方法观察受试样品在组织中的分布情况. 结果:ELISA检测结果表明,生理盐水组的小鼠血清及组织匀浆中均未检出IFN-α;IFN-α2b组的血清IFN-α浓度为(250±65)ng/L,但在各种组织匀浆中均未检出. IFN-α2b-NGR组的血清IFN-α浓度为(255±61)ng/L;肿瘤组织匀浆中的浓度为(191±71)ng/L,血清和肿瘤组织中IFN-α含量之比为100∶75;其他组织匀浆中未检出IFN-α2b. 免疫组化结果表明IFN-α2b-NGR分布于肿瘤血管内壁表面及组织间隙中. 结论:融合蛋白IFN-α2b-NGR具有对肿瘤组织的特异性结合能力,其结合位点位于肿瘤组织血管内皮表面.     

一个通用的TNFHis温度诱导融合表达载体的构建

以pBVTNF为起始质粒,设计合成了2个DNA片段一个含有起始码、TNF起始码后的2个氨基酸序列和6个组氨酸序列;另一个含有Thrombin和hydroxylamine裂解位点序列.将上述2个合成DNA片段分别与pBVTNF载体重组,获得了一个通用的TNFHis表达载体.在该表达载体中,含有6×His的纯化标签和Thrombin和hydroxylamine融合蛋白裂解位点.分别将IFN﹑ IL-11和TNF基因插入该表达载体的多克隆位点,42℃诱导表达后,经SDS-PAGE分析,结果表明,所有插入基因都获得了较高水平的表达.薄层扫描结果证实,所有融合表达蛋白的表达量均占菌体总蛋白的20%以上.Western blot 检测显示,所有融合表达蛋白均可与抗TNF-α单抗发生免疫反应,间接证明融合蛋白均获得了表达.TNFHisTNF和TNFHisIFN在温度诱导表达后,菌体裂解液经Ni-NTA Agarose Beads亲和柱纯化,纯化结果表明,TNFHis中的6×His序列可与Ni-NTA Agarose Beads结合.此种纯化方式为融合表达蛋白的分离纯化提供了方便.     

猪血小板衍生生长因子的提取和纯化

目的 :建立简单、有效的猪血小板衍生生长因子 (p PDGF)纯化方法。方法 :采用超声裂解、酸醇抽提、离子交换色谱、凝胶色谱等方法提纯 p PDGF,用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其相对分子质量 ,并检测其生物学活性。结果 :纯化的 p PDGF相对分子质量为 (2 .879～ 3.0 78)× 10 4,纯化倍数为 75 82倍 ,活性回收率为 3% ,比活性为 3.41176× 10 5 U/ mg。 结论 :提取和纯化 p PDGF的方法简单 ,且达到较好的结果 ,为进一步研究 PDGF的理化性质及生物学特性打下基础。     

PRL-3对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响

目的:构建肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3）基因过表达的重组慢病毒载体,研究其对结直肠癌细胞系HCT116迁移、侵袭能力的影响。方法:PCR扩增PRL-3基因并克隆至pcDH载体,构建成pcDH-PRL-3过表达载体,再将其与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装成Lenti-PRL-3重组慢病毒载体,并感染结直肠癌细胞系HCT116。利用qPCR、Western分别从mRNA、蛋白水平检测PRL-3表达情况;通过划痕实验、Transwell实验研究过表达PRL-3对结直肠癌细胞系HCT116侵袭能力的影响。结果:成功构建Lenti-PRL-3重组慢病毒载体,并在结直肠癌细胞系HCT116过表达。划痕实验、Transwell实验结果表明过表达PRL-3能够促进HCT116细胞的迁移、侵袭。结论:构建Lenti-PRL-3重组慢病毒载体,在结直肠癌细胞系HCT116过表达PRL-3后能增加细胞的迁移、侵袭能力。     

Angiostatin基因的克隆及在原核细胞中的表达

获得具有活性ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ的表达,为进一步开发应用奠定基础,方法：用ＰＣＲ方法从人纤维蛋白酶酶原基因中,获得ａｎｇｉｏｓｔａｉｎ（Ｋ１－３）的基因,用原核表达载体ｐＢＶ２２０,表达非融合ａｎｇｉｏｓｔａｉｎ（Ｋ１－３）。结果得到有抑制活性ａｎｇｉｏ－ｓｔａｉｎ（Ｋ１－３）的表达量较低。化：ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（Ｋ１－３）可在原核非融合蛋白表达载体中得到表达。     

肿瘤细胞中两种TNFR的表达及新型rhTNF对肿瘤细胞生长的影响

目的 探讨ＴＮＦＲｐ５５和ＴＮＦＲｐ７５在各种肿瘤组织中的表达与新型ｒｈＴＮＦ对肿瘤细胞生长的抑制作用的关系。方法应用免疫组织化学染色法，观察１２０例肿瘤组织和１０株体外培养的肿瘤细胞中，ＴＮＦＲｐ５５和ＴＮＦＲｐ７５的表达及分布。同时应用结晶紫摄入法，观察ｎｒｈＴＮＦ对肿瘤细胞生长的抑制。结果 在肿瘤组织和肿瘤细胞中，ＴＮＦＲｐ５５的阳性表达率分别为８２．５％和９９％，ＴＭＦＲｐ７５分别为 ８４．２％和９８．８％，不同类型肿瘤间的表达无明显差异（Ｐ＞０．０５）．ｎｒｈＴＮＦ可抑制ＳＷ４８０、ＳＧＣ７９０１、８９１０ＳＭＭＣ７７２１和ＢＥＬ７４０２这５株肿瘤细胞生长，但是不能抑制另外５株肿瘤细胞Ａ５４９、ＰＬＡ８０１、Ｈｅｌａ、Ｅｃａ１０９和ＧＲＣ－ｌ的生长。结论ＴＮＦＲ广泛存在于各种肿瘤细胞上，ｎｒｈＴＮＦ抑制肿瘤细胞生长的程度与ＴＮＦＲｐ５５的表达率无相关性。     

hTNFα- hPgnK5融合蛋白的原核表达及测定

目的：获得hTNFa-hPgnK5融合蛋白基因，在原核细胞中表达融合蛋白，探索其活性。方法：PCR法改造hTNFa基因，消除其终止密码子，构建hTNFa-hPgnK5融合蛋白基因，在大肠杆菌DH5α中表达该融合蛋白，测定其体外体制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性。结果：hTNFα基因经PCR法改造，去除了终止密码子，并在3′端引入BamHI位点，hTNFα-hPgnK5融合蛋白基因构建完成，并在原核系统中获得表达，免疫印迹反应表明该融合蛋白具有hPgnK5免疫活性，体外实验表明该融合蛋白可抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的增殖。结论：hPgnK5蛋白可与hTNFα一起表达，该融合蛋白有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性。     

重组人C22orf37融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的：构建人C22orf37基因的原核表达载体,表达并纯化C22orf37重组蛋白．方法：应用PCR方法从人外周血白细胞eDNA文库中获得人C22orf37基因,成功构建人C22orf37融合表达载体,诱导表达His—C22orf37融合表达蛋白并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot鉴定．应用镍螯合层析法纯化重组融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析．结果：成功构建了人C22orf37重组融合载体pQE30-C22orf37,工程菌pQE30-C220rf37／DH5α经IPTG诱导后的菌体蛋白经SDS—PAGE电泳分析,在Mr约18000处出现了一条新生的蛋白条带,Western Blot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合．应用Ni—NTA层纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白经Primer Premier软件分析纯度约80％．结论：成功构建了人C22orf37的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化了人C22orf37的融合蛋白,为下一步的C22orf37 mAb的制备和C22orf37蛋白表达的组织分布及功能研究奠定了基础．     

新型基因工程人肿瘤坏死因子-α的临床前研究

目的 研究一种新型基因工程人肿瘤坏死因子－α(nrhTNF-α)的临床前药理、毒理和药代动力学特性。方法 观察nrhTNF-α对动物移植性肿瘤的抑制作用、毒副作用（如急性中毒反应和死亡情况，过敏反应，以及对神经系统、呼吸系统、心血管系统、造血系统和免疫系统的影响）及药代动力学变化。结果 nrhTNF-α具有明显的抑瘤作用且呈剂量依赖性。对动物的急性中毒表现及病理变化与rhTNF-α相似，未见其他不良反应。结论 nrhTNF-α的抑瘤作用明显，毒副反应低，具有良好的临床应用前景。