重组胸腺素α1的分离纯化和活性测定

目的：利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1④,转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌,来分离纯化表达的胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1),方法将高效表达融合蛋白的工程菌用菌胞破碎器裂解,经80℃热处理,离心上清采用Q－SepharoseFF阴离子交换色色谱纯化Tα1单体,应用SDS－PAGE,2L－Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定。结果SDS－PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白牛菌体总蛋白的400g.kg^-1,经2L－Tricine-SDS-PAGE分析证实,融合蛋白可裂解出Tα1单体,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1单体,HPLC鉴定纯化的Tα1纯度可达950g.kg^-1以上,利用^3H-TdR进行的生物活性测定表明,在致有丝分裂原ConA存在的条件下,融合蛋白和Tα1单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的Tα1相比具有相似的生活性。结论该方法是分离纯化Tα1简便易行,经济有效的方法,同时也为Tα1的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础。     

生物制药学实验教学改革与实践

生物制药学是药学、生物技术专业重要的基础课,也是理论与实践相结合的一门课程。实验教学在生物制药学教学体系中占有十分重要的地位。根据生物制药学的特点和人才培养需求,教学者按照基因工程药物制备的基本流程,系统安排实验课内容,增加实验课时,创新性地让学生参与实验准备,同时开放实验室,改进实验考核方法。实践证明,相关教学改革提高了实验课教学质量,对践行素质教育和实验教学改革具有一定示范意义和参考价值。     

胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的：获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法：人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b（＋）中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果：Tα1②Mr约为6.3×10^3,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论：成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.     

Myostatin基因疫苗动物免疫效果的初步研究

目的:检测Myostatin基因疫苗的免疫效果,观察其对免疫动物的影响,为Myostatin基因疫苗的应用提供实验研究.方法:以Myostatin基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫小鼠,ELISA法测定其免疫小鼠血清的抗体滴度,通过全自动生化分析仪检测血清指标.以组织化学染色(HE)染色检测Myostatin基因疫苗对免疫小鼠骨骼肌的影响.利用Scion Image 4.02 分析Myostatin基因疫苗对免疫小鼠肌纤维横截面积的影响.结果:基因疫苗Myostatin能够诱导小鼠产生针对Myostatin的抗血清.与正常对照组比较,基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的动物平均体重增加了9.8%,股四头肌、腓肠肌和胸大肌分别增加了24.1%、10.9%和20.3%.结论:基因疫苗Myostatin能够诱导小鼠产生针对Myostatin的特异性中和抗体.Myostatin基因疫苗免疫的动物体重增加,肌细胞有肥大现象,肌肉质量明显增加.     

PRL-3表达载体构建及其对结直肠癌细胞生长的影响

目的:构建PRL-3过表达载体,研究其对结直肠癌细胞系SW620生长的影响。方法:提取Hela细胞总RNA并反转为cDNA,以cDNA为模板通过PCR反应扩增PRL-3基因,将扩增产物克隆至表达载体pcDNA3.1,通过转染让SW620细胞过表达PRL-3,空载体组和空白组作为阴性对照。qPCR、Western blot实验用来检测PRL-3在SW620细胞的表达水平,CCK-8实验、平板克隆形成实验用来检测SW620细胞的增殖状况,流式细胞术用来检测SW620细胞的周期分布。结果:成功构建了PRL-3过表达载体。与空载体组和空白组相比,PRL-3过表达载体转染结直肠癌细胞系SW620后,qPCR检测PRL-3表达水平上调数倍。CCK-8实验表明过表达PRL-3能够促进SW620细胞增殖。平板克隆形成实验表明上调PRL-3能够增强SW620细胞增殖能力。流式细胞术结果表明过表达PRL-3能够加快SW620细胞周期进程。结论:PRL-3能够促进结直肠癌细胞系SW620生长,为结直肠癌早期诊断和靶向治疗提供实验依据。     

人转铁蛋白受体结合肽的噬菌体肽库筛选与鉴定

目的：从噬菌体呈现12肽库中筛选与人转铁蛋白受体结合的肽．方法：以人转铁蛋白受体为靶蛋白，生物淘洗法从噬菌体呈现12肽库中筛选与之结合的阳性噬菌体，用噬菌体ELISA，FCM及免疫组化等方法检测阳性噬菌体与人转铁蛋白受体的结合活性．结果：从噬菌体肽库中筛选到-呈现SPRPRHTLRLSL肽的噬菌体，噬菌体ELISA，FCM及免疫组化等方法均证明呈现该肽的噬菌体可与人转铁蛋白受体或高表达人转铁蛋白受体的细胞结合．结论：SPRPRHTLRLSL具有与人转铁蛋白受体结合的活性，它为以转铁蛋白受体为靶点的导向性药物的开发提供了一个可能的线索．     

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的 真核共表达质粒**☆

背景：一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体，可提高转染和表达效率。 目的：利用多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin, MUC1)多肽骨架中含有许多连续重复系列，构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF，并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。 设计、时间及地点：基因重组体设计实验，于2005-09/2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。 材料：真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠，pGEM-3zf(-)-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E.coli DH5α为自备，雌性BALB/c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。 方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体，酶切鉴定及序列分析后，与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中，构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。 主要观察指标：通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。 结果：酶切鉴定及序列分析表明，重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF 的融合基因，在COS-7细胞中可检测到MUC1表达，重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。 结论：成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM-CSF 基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。     

SP94和CD47双修饰外泌体靶向递送PLK1 siRNA治疗肝癌

目的 设计一种基于外泌体高效递送的方法,将治疗性核酸递送到肝癌组织治疗原发性肝癌。方法 构建靶向肝癌的融合表达SP94和CD47的质粒,转染至HEK293T细胞后提取分离外泌体。通过透射电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析、蛋白质印迹法等方法对外泌体进行鉴定。小鼠经尾静脉分别注射200μg DiD标记的未修饰外泌体和SP94修饰的外泌体,采用小动物活体成像仪检测并分析外泌体对肝癌组织的靶向作用。将未修饰外泌体和CD47修饰的外泌体分别与巨噬细胞RAW264.7、小鼠肝癌细胞Hepa1-6共孵育,验证细胞对修饰后外泌体的吞噬情况。通过电穿孔法将Polo样激酶1(PLK1)siRNA加载到不同修饰的外泌体中,再与Hepa1-6细胞共孵育,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。原发性肝癌模型小鼠经尾静脉注射加载PLK1 siRNA的修饰外泌体,系统研究并分析其对原发性肝癌的治疗效果。结果 SP94修饰增强了外泌体对肝癌组织的靶向作用,CD47修饰减少了外泌体被巨噬细胞吞噬。SP94和CD47双修饰外泌体递送PLK1 siRNA促进了肝癌细胞凋亡。在原发性肝癌模型小鼠中,SP94和CD47双修饰外泌体加载P...     

可溶性人PD-1IgV(shPD-1IgV)活性检测及抑瘤作用的观察

目的:检测可溶性人PD-1IgV(shPD-1IgV)的活性,观察其抑瘤效果. 方法:利用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,对其进行复性得到可溶性人PD-1IgV(shPD-1IgV). 通过结合ELISA和竞争ELISA检测shPD-1IgV生物学活性,计算抑瘤率检测其抑瘤效果. 结果:高效气相色谱分析结果表明纯化复性的shPD-1IgV蛋白的纯度达到95%以上;shPD-1IgV能够分别与鼠源性和人源性B7H1/Fc结合;其与人源性B7H1/Fc的结合可被抗人B7H1 mAb阻断;治疗组抑瘤效果与对照组比较具有统计学意义(P＜0.05). 结论:纯化复性的可溶性人sPD-1IgV具有很高的纯度和生物学活性,体内显示了良好的抑瘤效果.     

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的: 构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1. 方法: 应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析. 结果: 成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1, 表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力. 结论: 成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.