鼠骨骺干细胞免疫纯化和pTRE-PTHrP(38-94)反应质粒的构建

目的 免疫纯化新生大鼠骨骺干细胞,克隆甲状旁腺相关蛋白的中间片段PTHrP(38-94)基因并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(38-94).方法 采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的骨骺干细胞,分别以FGFR-3抗体和PCNA抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP(38-94)基因片段,扩增的DNA片段与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接,转化、扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定.结果 免疫荧光证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞;经限制性内切酶Barn H I、Not Ⅰ酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的 基因已经插入重组质粒.结论 运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞;成功克隆PTHrP(38-94)基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(38-94),为进一步明确PTHrP(38-94)片段的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.     

新生大鼠前软骨干细胞株的体外培养分选、鉴定及永生化研究

背景:前软骨干细胞虽然具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,但生物学性状不稳定,易分化。导入外源性基因能使其永生化,且不改变细胞的表型和性状。目的:建立永生化大鼠前软骨干细胞株,为以后精确调控前软骨干细胞的增殖与分化打下基础。设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-10/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。材料:出生<24h的新生SD大白鼠,雌雄不限,用于取前软骨干细胞。方法:用LipofectamineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代前软骨干细胞进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养。主要观察指标:①前软骨干细胞的生物学性状。②质粒鉴定。③用免疫细胞化学方法和反转录聚合酶链反应鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。④反转录聚合酶链反应结果。⑤细胞生长曲线。结果:①免疫磁珠分离获得细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性。②双酶切质粒,电泳证实pCMV为3kb,SV40T基因为2.3kb。③嘌呤霉素分离获得转化后细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性。④提取RNA后用反转录-聚合酶链反应法成功扩增出588bp的片段。转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞。⑤贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论:在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端中分离、培养出前软骨干细胞,pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。     

甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控

背景：甲状旁腺素相关蛋白-印第安刺猬蛋白两者相互作用调节着骨骺区软骨的分化成熟及增殖,促使骨骺区细胞处于一种相对稳定的状态。 目的：分析甲状旁腺相关蛋白亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)对骨骺干细胞的调控作用以及PTHrP(107-139)与其他调控因子的影响。 方法：用脂质体介导的基因转染技术将质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)分别转染pTet-on骨骺干细胞株,放入诱导分化培养基中进行培养,加入1 mg/L的强力霉素进行诱导,以RT-PCR的方法检测增殖细胞核抗原基因的表达变化。再次将质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染pTet-on骨骺干细胞株,加入不同浓度的强力霉素进行诱导,应用RT-PCR的方法检测Ⅱ型胶原、X型胶原、印第安刺猬蛋白、Ptc、Sox9、骨形态发生蛋白6基因的表达变化。 结果与结论：强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组的增殖细胞核抗原表达明显高于质粒pTRE-PTHrP(1-36)转染组和质粒pTRE-PTHrP(38-94)转染组;在强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP (107-139)转染组中Ⅱ型胶原、Sox-9表达明显增强,Ihh表达未见明显变化,而 Ptc、X型胶原、骨形态发生蛋白6表达明显降低。而且其表达量与强力霉素存在剂量依赖性。提示PTHrP (107-139) 可能是通过调控Sox-9、Ptc、骨形态发生蛋白6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的,而PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)对前癌干细胞的增殖并无明显作用。pTet-on质粒系统在前癌干细胞能有效的调控外来基因的表达。     

生长分化因子5诱导大鼠软骨前体细胞向成软骨方向分化

背景:生长分化因子5和软骨前体细胞都在肢体纵向发育中发挥重要作用.目前尚无生长分化因子5对软骨前体细胞影响的文献报道.目的:实验创新性构思重组生长分化因子5干预软骨前体细胞,希望得到生长分化因子5诱导软骨前体细胞向软骨细胞分化的证据.设计、时间及地点:细胞形态学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成.材料:纯系清洁级新生24 h内的SD大鼠12只,用于制备软骨前体细胞.生长分化因子5为PeproTech公司产品.方法:免疫磁珠分离纯化软骨前体细胞.取第3代细胞,分别用含0,10,50和100 μg/L的完全软骨形成培养基干预,诱导14 d.对照组采用低糖DMEM培养基.主要观察指标:光镜观察细胞形态和生长增殖,四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖活性,阿利新蓝染色蛋白聚糖,应用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原的表达.结果:分离纯化的软骨前体细胞贴壁牢固,生长旺盛,折光度好,光镜下呈多角形或梭形. 软骨前体细胞的增殖在48 h内呈剂量依赖性增高,100 μg/L生长分化因子5组细胞的增殖率显著高于其他组(P<0.05).诱导14 d后阿利新蓝染色阳性,细胞外基质中有明显的蛋白聚糖形成.在生长分化因子5干预软骨前体细胞第7天,Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白出现表达,并且14 d持续表达.结论:生长分化因子5能够促进软骨前体细胞的增殖分化.     

甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控

背景：甲状旁腺素相关蛋白-印第安刺猬蛋白两者相互作用调节着骨骺区软骨的分化成熟及增殖,促使骨骺区细胞处于一种相对稳定的状态。目的：分析甲状旁腺相关蛋白亚基因PTHrP（1-36）、PTHrP（38-94）和PTHrP（107-139）对骨骺干细胞的调控作用以及PTHrP（107-139）与其他调控因子的影响。方法：用脂质体介导的基因转染技术将质粒pTRE-PTHrP（1-36）、pTRE-PTHrP（38-94）和pTRE-PTHrP（107-139）分别转染pTet-on骨骺干细胞株,放入诱导分化培养基中进行培养,加入1mg/L的强力霉素进行诱导,以RT-PCR的方法检测增殖细胞核抗原基因的表达变化。再次将质粒pTRE-PTHrP（107-139）转染pTet-on骨骺干细胞株,加入不同浓度的强力霉素进行诱导,应用RT-PCR的方法检测Ⅱ型胶原、X型胶原、印第安刺猬蛋白、Ptc、Sox9、骨形态发生蛋白6基因的表达变化。结果与结论：强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP（107-139）转染组的增殖细胞核抗原表达明显高于质粒pTRE-PTHrP（1-36）转染组和质粒pTRE-PTHrP（38-94）转染组;在强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP（107-139）转染组中Ⅱ型胶原、Sox-9表达明显增强,Ihh表达未见明显变化,而Ptc、X型胶原、骨形态发生蛋白6表达明显降低。而且其表达量与强力霉素存在剂量依赖性。提示PTHrP（107-139）可能是通过调控Sox-9、Ptc、骨形态发生蛋白6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的,而PTHrP（1-36）、PTHrP（38-94）对前癌干细胞的增殖并无明显作用。pTet-on质粒系统在前癌干细胞能有效的调控外来基因的表达。     

短节段骨水泥螺钉内固定联合椎体成形术治疗Ⅲ期Kümmell病的疗效研究

目的 评估短节段骨水泥强化椎弓根螺钉固定联合椎体成形术治疗Ⅲ期Kümmell病的临床疗效。方法 回顾性分析2016年9月至2020年9月我科收治的24例Ⅲ期Kümmell病病人,年龄为65~93岁,均采用短节段骨水泥强化椎弓根螺钉内固定联合椎体成形术治疗,记录术前、术后7 d、末次随访时的疼痛视觉模拟量表（visual analogue scale,VAS）评分、Oswestry功能障碍指数（Oswestry disability index,ODI）,测量X线片上病椎Cobb角、椎体前缘及后缘高度,根据术后病椎X线片观察骨水泥填充及渗漏情况。结果 24例病人平均随访12个月（6~22个月）。病人术中无血管神经损伤、椎管内骨水泥渗漏等严重并发症发生,术后24~72 h下地行走。3例术后12个月内出现邻近节段或其他椎体骨折,采用经皮球囊扩张椎体后凸成形术（percutaneous kyphoplasty,PKP）治疗后症状缓解。术后7 d及末次随访时的VAS评分、ODI和病椎Cobb角较术前显著降低,椎体前缘高度较术前显著升高,与术前比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;但末次随访时的数值与术后7 d时的比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。术后7 d及末次随访时的椎体后缘高度与术前比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 短节段骨水泥强化椎弓根螺钉内固定联合椎体成形术治疗Ⅲ期Kümmell病,能够安全有效地改善临床症状、恢复病椎高度,并且对脊柱后凸畸形有满意的矫正效果。     

大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源.[方法]采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞,利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的质粒pCMVSV40T/PUR转染骨骺干细胞,经嘌呤霉素筛选,抗性克隆扩大培养.应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色,观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线.用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达.[结果]转染后获得一个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性.SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞.转染细胞经扩大培养,命名为永生化骨骺干细胞.[结论]成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株.     

C端甲状旁腺相关肽的克隆及其对骨骺干细胞的调控作用

目的 探讨C端甲状旁腺相关肽(PTHrp107-139)对体外培养的骨骺干细胞的调控作用以及与其他调控因子的关系.方法 采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法克隆大鼠PTHrp全长中的107～139片段,并将其亚克隆至质粒pTRE2hyg上,构建新的质粒pTRE2hyg-PTHrp107-139并将其与质粒pTet-on共转染分离纯化的骨骺干细胞,放入含有维生素C和地塞米松的全培养基中进行培养,分别加入0.1、0.5、2.0mg/L的强力霉素(Doxycycline)进行诱导,并设置空白对照.48～72 h后抽提各组细胞的RNA进行逆转录,然后通过半定量PCR的方法检测增殖细胞核抗原(PC-NA、SOX9等基因的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡.结果 加入DOX组的PCNA、ColⅡ、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Sox9表达增加,骨骺干细胞数量明显增多,而Ptc、Col X、骨形态发生蛋白(BMP)-6表达减少.结论 C端甲状旁腺相关肽可能有促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的作用,但对细胞凋亡无明显影响.     

SV40T抗原基因永生化新生大鼠前软骨干细胞株的构建

目的建立永生化大鼠前软骨干细胞（PSCs）株，为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用LipofectamineTM2000介导基因转染，将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达，用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养，观察细胞形态及生长状况，绘制细胞生长曲线，用免疫细胞化学方法和RT PCR鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。结果分离获得转化细胞阳性克隆，用免疫组化证实FGFR 3表达阳性，提取RNA后用RT PCR法成功扩增出588 bp的片段。转染细胞经扩大培养，命名为永生化前软骨干细胞。贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为 (22.98±2.77) h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论在体外培养条件下，可以从新生大鼠干骺端分离、培养出前软骨干细胞，pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。