氢醌作用下L-O2人肝细胞中聚合酶η的表达及其与DNA损伤耐受的关系

目的 研究氢醌(hydmquinone,HQ)对L-O2人肝细胞中跨损伤合成DNA聚合酶η(Pohη)表达及DNA损伤的影响,探讨Polη在DNA损伤耐受过程中的作用及其可能机制.方法 将L-O2人肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160 μmol/L) 的HQ作用24 h之后,采用噻唑蓝(MTY)比色法测定细胞相对存活率;单细胞凝胶电泳检测DNA损伤情况;实时荧光定量PCR和Western blotting 技术检测Polη在mRNA 和蛋白质水平上的表达.结果 在0～80 μmol/L 的范围内,HQ对L-O2人肝细胞的存活率没有明显的影响;当染毒剂量超过160 μmol/L 时,其存活率则降为(79.20±7.94)%,与对照组(100.00±3.71)%比较,差异有统计学意义(F=17.11,P＜0.01).随着HQ作用浓度的升高,L-O2人肝细胞DNA链的断裂程度也随着逐渐增加.在HQ染毒剂量0～80μmol/L 的范围内,Polη在mRNA水平(相对定量值依次为1.00±0.00、1.20±0.09、2.02±0.19、2.37±0.10、2.67±0.16和4.40±0.18)和蛋白质水平(相对定量值依次为0.22、0.24、0.34、0.44、0.45和1.25)上的表达均有随着剂量的增加而增加的趋势,80 μmol/L 处达到峰值;当HQ的剂量达到160 μmol/L时,Polη的表达则有所降低,mRNA水平和蛋白质水平相对定量值分别为2.32±0.16和1.20,高于对照组.结论 Polη可能参与了HQ所致L-O2 人肝细胞DNA损伤的耐受过程.     

用Taqman MGB探针研究中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性

 【目的】了解中国人群肿瘤坏死因子α（the tumour necrosis factor α，TNF-α）基因启动子区多态性。【方法】 随机选取20名深圳地区汉族健康体检者，采用两对引物PCR扩增TNF-α基因启动子区（-1389nt～＋125nt），对PCR产物进行序列分析，寻找单核苷酸多态性位点（single nueleofide polymorphisms，SNPs）。采用Taqman MGB探针建立了-857nt（C／T）位点的实时定量PCR（thereal-time PCR）分型方法，并对中国汉族、壮族、布依族，水族及苗族群体共l108份样本进行了基因分型。【结果】在启动子区（-1322nt～＋67at），发现6个SNP位点，即-885（A／G）、-863（C／A）、-646（G／A）、-648（G/A）、-568（G／C）和-857（C/T），其中位点-646nt（G→A）为新发现SNP。-885、-648及-568nt位点碱基虽然与Genbank不同，但测序的20个个体基因分型相同。中国人群-857nt（C／T）位点基因型频率分别为0．79（CC），0．19（CT）和0．02（TT），中国汉族、壮族、布依族，水族及苗族群体间无显著性差异。中国人群-857T等位基因频率为0．116，与文献报道的韩国人群相同，但比日本人群低。【结论】中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性可能较保守。采用Taqman MGB探针实时定量PCR技术对SNPs进行基因分型简便、快速及准确，易于自动化，为大规模的疾病相关性研究提供了有效的工具。     

实时RT-PCR基因表达相对定量REST(C)软件分析与2(-△△CT)法比较

目的利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株（16HBE）eDNA为模板5倍系列稀释，分别作DNA聚合酶K（POLK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘（anti-BPDE）诱导的16HBE、anti—BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株（H1299）cDNA为模板，进行实时定量RT—PCR。以GAPDH基因作为内参照，进行POLK基因表达相对定量。实验数据分别采用2^（-△△CT）法及REST软件分析。结果5倍系列稀释法制作的标准曲线，呈现较好的线型关系（Rsq 0．997）。POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117．5％和103．5％。采用2^（-△△CT）法计算出的表达比值均比REST软件分析高。结论实时RT-PCR技术结合REST软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。     

中国汉族人群DYF155S1位点等位基因结构研究

[目的]为建立一种简便、实用的 DYF155S1位点多态性分析技术提供依据。[方法]采用扩增片段长度多态性(Amp-FLP)方法,调查中国汉族人群155个无关男性个体DYF155S1位点长度的变异情况。PCR扩增产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显示条带。用循环测序法对该位点的10个等位基因进行正向和反向序列分析。[结果]以基因组 DNA为模板,用一对引物可同时扩增出 DYF155S1和DYF155S2 2个位点的等位基因。DYF155S1位点表现出有长度多态性,这些等位基因约 1500～2 500 bp。DYF155S2位点表现出有或缺失的二态现象,缺失率约为7.1％。发现有4种变异的核心序列,其中3种与文献报道一致,被命名为1型、3型和4型,另一种为新发现的变异核心序列,暂命名为7型。10个等位基因具有相同的模块结构,在5’端表现为3型-1型-3型排列,在3’端则表现为 4型-3型排列。[结论]中国汉族人群DYF155S1位点 5’端序列较3’端的多态性高。     

中国汉族人群DYF155S1位点等位基因结构研究

[目的]为建立一种简便，实用的DYF155S1位点多态性分析技术提供依据。[方法]采用扩增片段长度多态性（Amp-FLP)方法，调查中国汉族人群155个无关男性个体DYF155S1位点长度的变异情况。PCR扩增产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显示条带，用循环测序法对该位点的10个等位基因进行正向和反向序列分析。[结果]以基因组DNA为模板用一对引物可同时扩增出DYF155S1和DYF155S22个位点的等位基因。DYF155S1位点表现出有长度多态性，这些等痊基因约1500-2500bp。DYF155S2位点表现出有或缺失的二态现象，缺失率约为7.1%。发现有4种变异的核心序列。其中3种与献报道一致，被命名为1型，3型和4型，另一种为新发现的变异核心序列，斩命名为7型。10个等痊基因具有相同的模块结构。在5′端表现为3型-1型-3型排列，在3′端则表现为4型-3型排列。[结论]中国汉族人群DYF155S1位点5′端序列较3′端的多态性高。     

寨卡病毒感染早期快速抗原检测方法的建立

目的建立检测非结构蛋白1(NS1)抗原的免疫层析胶体金试纸方法,用于寨卡病毒(ZIKV)感染的早期诊断。方法对已获得的5株人源抗ZIKV NS1的单克隆抗体(ZKns2E11、ZKns3G2、ZKns4B8、ZKns4F10、ZKns14G5)采用生物膜层光学干涉法进行竞争抑制实验,以得到它们在抗原结合位点的相互关系并根据抗体结合抗原表位的不同将其进行分类,又通过两两随机组合配对方法筛选出最佳捕获抗体及包被抗体,制备成胶体金试纸。分别用重组NS1蛋白、感染ZIKV细胞培养上清液以及感染登革病毒(DENV)病人血清/血浆多种检测样品以获得准确的特异性和敏感性。其中病毒定量采用FFA(focus-forming assay)方法。结果在竞争抑制实验结果中,根据抗体与抗原结合的剩余结合率(20%被认为强竞争关系即结合位点相似甚至相同,60%被认为无竞争关系即位点不同),抗体大致分为两类,并通过两两配对筛选出2株结合位点不一致的最佳配对抗体(ZKns2E11、ZKns3G2),最终建立检测ZIKV NS1抗原胶体金试纸的快速诊断方法。在试纸敏感性分析中,ZIKV重组NS1蛋白为31.25 ng/mL时肉眼仍可观测到阳性条带的出现,以2×10~4FFU/mL的ZIKV病毒量感染细胞所释放的NS1蛋白仍可被检测到。试纸在其特异性上,无论是重组蛋白、感染病毒细胞培养上清液还是临床样本,与DENV均不交叉,表现出良好的特异性。该检测方法的成功建立为ZIKV感染早期诊断带来了一定的补充作用。结论建立检测ZIKV NS1抗原胶体金试纸的方法可成功区分ZIKV和DENV,表现出良好的敏感性及特异性,为ZIKV与DENV共感染地区提供了技术储备。     

食品添加剂诱导8-羟基鸟嘌呤糖基酶的实验研究

目的　探讨食品添加剂KBrO3对哺乳类组织中 8 羟基鸟嘌呤糖基酶的氧化诱导作用。方法　比较用KBrO3处理大鼠后 ,其肾和肝中修复酶活性的变化规律。酶活性分析用高效液相色谱 电化学检测法。结果　腹膜下给予 80mg kg剂量KBrO3后 ,在肾脏发现酶活性在 3h时显著升高 ,而在 6h时 ,其活性达到高大值 (1 2 5± 0 14 )pmol,该值是 0h的 6倍。然后 ,活性开始下降并在 12h回到 0h水平 ;不加处理时 ,其活性只有 (0 2 0± 0 0 6 )pmol,而在 2 0、4 0、80及 16 0mg kgKBrO3腹膜下给予时 ,其活性分别是 (0 33± 0 0 9)、(0 5 3± 0 10 )、(0 75± 0 13)及 (1 30± 0 0 8)pmol,在 4 0mg kg以上时活性显著增高 ,且显示剂量反应关系。在肾中观察到该酶活性变化是时间与剂量依赖性的 ,而在肝中未发现这种变化。结论　哺乳类组织中 8 羟基鸟嘌呤糖基酶能被氧化诱导 ,提示DNA中氧化损伤的修复是机体在有氧环境中生存的重要过程。     

POLH基因实时荧光定量PCR检测条件的建立

研究表明,环境化学污染物可以引起各种类型的DNA损伤,而POLH基因与DNA损伤所引起的细胞内反应即DNA的跨损伤合成(translesion synthesis,TLS)有关.因此,有必要寻找出一种敏感度极高的方法来检测POLH基因在mRNA水平上的表达变化,从而为探讨POLH基因在环境化学污染物所诱导的跨损伤DNA合成中的分子作用机制提供相应的线索.     

三氯乙烯职业中毒皮肤损害与HLA-DR、DQ基因相关性研究

[目的]从HLA-DR、DQ基因角度探讨三氯乙烯职业中毒皮肤损害易感的遗传背景.[方法]采用PCR-SSP(sequence specific primer)法对三氯乙烯职业中毒皮肤损害组(病例组)及对照组进行HLA-DR、DQ基因位点等位基因分型.[结果]HLA-DRB1位点在病例组检出11个等位基因,11个血清型;对照组检出13个等位基因,13个血清型.HLA-DQB1位点在病例组及对照组均检出5个等位基因,7个血清型.获得了各等位基因分布及基因频率资料,其中DRB1*09(DR9)和DQB1*03(DQ9)等位基因频率在病例组与对照组间差异均有显著性(P＜0.05);OR值(95%可信区间)分别为DRB1*09(DR9)等位基因为0.174(0.037～0.830),DQB1*03(DQ9)等位基因为0.226(0.046～1.108).[结论]DRB1*09(DR9)和DQB1*03(DQ9)等位基因可能是三氯乙烯职业中毒皮肤损害的保护基因.     

三个短串联重复序列位点的等位基因遗传变异研究

目的 探讨短串联重复序列（short tandem repeats,STRs）遗传变异的方式及机理。方法 用银染方法对3个STR位点（FGA、D12S391、D11S554)共19个发生突变的家系父、母、子的DNA样本进行SRT基因分型，将需测序的等位基因条带从凝胶上切下，再进行PCR扩增，产物经纯化作为测序模板，采用循环测序法测序。结果 19个家系中有18个家系子代新产生的等位基因变异表现为一个重复单位的增加或减少（表现为一个重复单位增加的有8个家系，减少的有7个家系，不确定的有3个家系），只有1个家系表现为2个重复单位的减少，子代新产生的等位基因来自父亲的有13个家系，来自母亲的有3个家系，不能确定的有3个家系，来自父与母的比较约为4：1。3个STR位点等位基因突变都出现在长的、连续的四核苷酸重复区（FGA的“CTTT”区、D12S391的“AGAT”区、D11S554的“AAAG”区）。结论 FGA、D12S391和D11S5543个STR位点的等位基因突变主要表现为一个重复单位的增加或减少占95％，其次是两个重复单位的变化，没有碱基的插入或缺失，突变主要来自父亲，在这3个STR位点中的长的、连续的四核苷酸重复区可能是等位基因突变的敏感点。