肝癌血清岩藻糖基化AFP含量与α-L-岩藻糖苷酶活性的相关分析

采用改良的分光光度法及豌豆凝集素亲和免疫电泳同步测定90例肝细胞癌(HCC)血清α-L-岩藻糖苷酶(AFU)活性和岩藻糖基化甲胎蛋白(AFP)含量。相关分析表明,HCC血清AFU活性与岩藻糖基化AFP相对含量无关(r=0.099),与岩藻糖基化AFP绝对含量亦无关(r=0.23)。将90例HCC按岩藻糖基化AFP相对含量不同(以25％为界)分组,两组血清AFU活性分别为535±220 nmol·ml~(-1)·h~(-1)和550±180 nmol·ml~(-1)·h~(-1),相差不显著(P>0.05)。若以血清AFU活性高低(以550 nmol·ml~(-1)·h~(-1)为界)分组,两组血清岩藻糖基化AFP相对含量分别为40％±23％和45％±22％,差异亦不显著(P>0.05)。提示,肝脏病变时AFP糖链结构的变化不是血清AFU参与的结果,可能来自于糖链生物合成途径的改变。     

野生型p53基因提高肝癌细胞化疗药物敏感性的实验研究

目的:研究野生型p53(wtp53)提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用.方法:采用p53基因型不同的三种人肝癌细胞株HepG2 (部分wtp53)、Hep3B(p53-/-)和 PLC/PRF/5(mtp53),观察携wtp53基因的重组腺病毒联合化疗药物争光霉素(bleomycin,bleo)、丝裂霉素(mitomycin, mito)或甲氨蝶呤(methotrexate, meth)对肝癌细胞的杀伤效应.结果:HepG2、Hep3B和 PLC/PRF/5分别耐受600 μg/ml bleo、100 μg/ml mito或1 000 μg/ml meth,但转入wtp53基因后再使用上述质量浓度范围的化疗药物,则肝癌细胞出现了明显的被杀伤效应.结论:wtp53基因能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,wtp53基因联合化疗药物治疗可望开辟克服肝癌耐药的新途径.     

肝癌血清α-L-岩藻糖苷酶对甲胎蛋白糖基上岩藻糖的水解作用

采用改良的分光光度法及豌豆凝集素亲和免疫电泳,初步研究了肝细胞癌(HCC)患者血清α—L一岩藻糖苷酶(AFU)对甲胎蛋白(AFP)糖基上岩藻糖的水解活性,旨在探讨HCC酶标记物与蛋白质标记物在生化代谢过程中的相互关系。结果表明:(1)当牛AFU(美国Sigma)以0.3U/ml含量与岩藻糖化AFP纯品同溶于pH4.5,0.025mol/L柠檬酸钠缓冲液,在37℃温育24h后发现,人AFP分子上的岩藻糖基可     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

人肝癌细胞肿瘤抑制基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的为了解肿瘤抑制基因ｐ５３和Ｒｂ基因与肝癌对药物敏感性之间的关系，本实验用逆转录病毒介导将野生型ｐ５３或Ｒｂ基因导入人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１并观察其药物敏感性的改变。方法将野生型ｐ５３ｃＤＮＡ或ＲｂｃＤＮＡ克隆在逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，转染人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１，筛选阳性克隆，同时以空载体ｐＬＸＳＮ和反义ｐ５３基因作为对照，免疫组化检测ｐ５３或Ｒｂ基因的表达。加入化疗药物４８ｈ后掺入３Ｈ－ＴｄＲ，１８ｈ后检测ＣＰＭ值。结果成功地构建了分别含野生型ｐ５３、Ｒｂ或反义ｐ５３的逆转录病毒载体，转染ＳＭＭＣ７７２１细胞系后获得了ｐ５３或Ｒｂ的表达；与亲代７７２１细胞相比，ｐ５３或Ｒｂ的表达阳性的７７２１细胞的生长速度均明显减慢，ｐ５３表达阳性的７７２１细胞对阿霉素的敏感性明显增强，同样条件下，Ｒｂ在７７２１细胞系内的表达则对阿霉素敏感性无影响。结论野生型ｐ５３基因转染能提高人肝癌７７２１细胞对阿霉素的敏感性     

内源性凝集素介导的MTX-拟糖蛋白对肝癌细胞的靶向杀伤作用

内源性凝集素是一类存在于动物体内的糖结合蛋白.近年来发现了肿瘤内源性凝集素后,人们开始研究糖蛋白作为靶向载体的可能.为探索肝癌内源性凝集素在拟糖蛋白一药物靶向中的作用,本研究制备了7种MTX-拟糖蛋白,在体外观察了这些复合物对肝癌细胞的杀伤作用.     

CD45分子在NK细胞激活中的作用及其分子机制研究

为研究NK细胞表面分子在NK细胞激活及释放细胞园子中的作用及其机制，作者用系列粘附分子单抗、配体及基困转染细胞刺激或共刺激NK细胞．定量检测IFN-γ的分泌。结果表明，CD45分子交联可独立擞话NK细胞，CD45分子的信号传递作用对CD16分子无依赖性。随着NK细胞的成熟与分化．其表面CD45分子的表达呈现RA向RO变化的特征．而RO的交联，对NK细胞的刺激显著强于RA的交联。CD22α和CD22β基因转染细胞能显著粘附NK细胞系NK3.3(RO’)，但并不能有效刺激其产生IFN-γ。作者推测．CD45分子．尤其是CD45RO．是NK细胞表面独特的信号传递分子，通过直接激活Src家横的PTK成员．开启独立的、非CDl6分子参与的NK细胞内信号传递途径。     

选择性增殖腺病毒CNHK500治疗乳腺癌的实验研究

目的: 观察选择性增殖腺病毒CNHK500对乳腺癌的特异性杀伤作用.方法: 行病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK500选择性复制和杀伤能力; Western blot检测腺病毒E1A和E1B在细胞中的表达.结果: CNHK500在乳腺癌细胞中复制能力与野生型腺病毒wtAd5相似,较ONYX-015增殖能力强.在正常成纤维细胞中CNHK500病毒增殖能力明显减弱, 较wtAd5增殖能力弱1 000倍左右.CNHK500可有效杀伤乳腺癌细胞株;而CNHK500对正常成纤维细胞的杀伤力较wtAd5减弱约100倍.CNHK500病毒的E1A可以选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞株中表达,在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株BJ中不表达, CNHK500可以选择性地在缺氧条件下表达E1B.动物实验结果显示,静脉注射CNHK500可以显著抑制MCF-7乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长,治疗效果与给药剂量相关.结论: 肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK500可选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞中复制,并产生体内外杀伤作用.     

经不同途径应用NK-NKG5-SV细胞防治肝细胞肝癌的研究

目的研究NKG5-SV导入肝癌病人NK细胞对其抗肝细胞肝癌作用的影响.方法Percoll不连续密度梯度离心法分离肝癌病人外周血NK细胞,以逆转录病毒为载体将NKG5-SV基因和报告基因LacZ导入NK细胞.将不同NK细胞与LCI-D20裸鼠人肝癌同时皮下接种或待LCI-D20肿瘤成瘤后瘤内注射,观察对肿瘤成瘤和生长的影响.术中经切缘或脾内注射不同的NK细胞,观察其对LCI-D20肝癌切除术后转移复发的影响.结果不同NK细胞与LCI-D20肝癌同时皮下接种NK-NKG5-SV细胞组成瘤率、肿瘤直径(cm)均低于NK-LacZ细胞组(P均小于0.01).肿瘤内注射不同NK细胞,NK-NKG5-SV细胞组的肿瘤生长明显低于NK-LacZ细胞组(P均小于0.05).肝癌切除术中应用NK细胞对照组、NK-LacZ细胞组、NK-NKG5-SV细胞组切缘复发瘤直径、肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数、转移灶累及腹内部位数分别为切缘注射1.51±0.47、0.86±0.49、00±1.76,2.40±1.80、0.80±0.54、0.40±1.18,01),2.60±0.70、1.40±0.54、1.0.50=0.19(P＜0.4.20=2.16、1.80±0.13、0.60±0.54(P＜0.05).脾内注射1.18±0.34、0.86±0.40、0.70±0.35,2.40=1.6 7、0.60±0.89(P＜0.05)、0.40±0.89(P＜0.05),2.2±1.09、0.4±0.54(P＜0.05)、0.2± 0.01(P＜0.01).4.60±1.14、1.20±1.70(P＜0.01)、0.80±1.09(P＜0.01).结论NK细胞具有抑制LCI-D20肝癌生长及防治肝癌切除术后转移复发的作用.NKG5-SV基因转染NK细胞后可提高NK细胞的抗肝癌作用.     

凝集素亲和电泳-免疫印迹法检测甲胎蛋白变异体

甲胎蛋白(AFP)是一个公认的肝细胞癌(HCC)标记物.然而,部分慢性肝炎、肝硬化等良性肝病亦可合成少量AFP.由于糖基化过程的差异,不同疾病状况下肝细胞分泌的AFP 在糖链结构上并不相同.为了鉴别AFP是产生于恶性肝癌细胞还是良性肝病细胞,人们已建立多种 AFP糖链变异体测定方法.新近的报告表明, AFP糖链变异体测定还有助于HCC复发转移的监测和预后的判断[1,2].我们在已建立的凝集素亲和免疫电泳自显影法[3]的基础上,又建立了操作更简便、敏感度更高的凝集素亲和电泳-免疫印迹法,并初步用于良恶性肝病的AFP糖链变异体检测.