携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的腺病毒载体的构建及体外抗肿瘤活性的研究

目的　构建携带人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)基因的腺病毒载体 ,评价TRAIL对人肺癌、肝癌细胞的基因治疗功效。方法　构建携带人TRAIL基因的腺病毒Ad hTRAIL ,感染人肺癌细胞株H 460、A5 49,人肝癌细胞株Hep3B、HepGII以及人正常肝细胞株WRL 68,人正常成纤维细胞株MRC 5 ,通过酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测hTRAIL的表达 ,并进行四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测其杀伤肿瘤细胞的效能。结果　成功构建携带人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒载体Ad hTRAIL ,感染H 460、A5 49、Hep3B、HepGII、WRL 68细胞 ,72h后上清中TRAIL表达量分别为 3 2 .75、2 4.5 3、3 4.0 2、3 2 .89、17.0 8μg/L。在MOI =1时 ,Ad hTRAIL即可引起肿瘤细胞明显凋亡 ,而在MOI =10 0时对正常细胞WRL 68、MRC 5也没有明显杀伤作用。结论　腺病毒载体携带人TRAIL基因在肿瘤基因治疗方面有非常广阔的应用前景。     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及体外初步研究

目的　构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。方法　克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1 5 ) ,命名为hA。利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中 ,通过病毒增殖试验、电镜技术、Westernblot分析、鸡胚尿囊膜试验 (CAM ) ,观察CNHK2 0 0 hA的复制情况、hA基因的表达及其对新生血管生成的抑制作用。结果　构建了一种新型的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。该治疗系统为E1b 5 5× 10 3 蛋白缺失而保留了腺病毒E1a蛋白的 5型腺病毒 ,能在肿瘤细胞内大量增殖及复制 ,而在正常细胞内增殖能力较弱 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。同时CNHK 2 0 0 hA携带人抗肿瘤新生血管生成基因hA ,能在肿瘤细胞内高效表达hA蛋白 ,其表达量高于传统基因治疗的腺病毒载体系统。电镜证实该治疗系统可在肺癌A5 49细胞株中复制及增殖。CAM试验证实该治疗系统感染肺癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论　基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能在肿瘤细胞中增殖复制 ,并明显提高hA基因的表达量 ,表达产物具有抑制新生血管形成的作用。     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因．病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin（CNHK300-mE），以肿瘤增殖病毒为载体，携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子插入腺病毒E1A基因上游，将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间，通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE，该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGⅡ中大量增殖及复制，而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d，小鼠内皮抑素的表达量为1000μg／L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制，并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。     

血清α-甘露糖苷酶活性的比色测定法

复合糖在正常的生命活动中起着十分重要的作用.体内复合糖代谢维持在一个相对恒定的状态,这种恒定状态直接取决于复合糖合成酶和分解酶之间的平衡.肿瘤时,组织和血清中复合糖的改变与糖苷酶     

局部注射小鼠白细胞介素12逆转录病毒包装细胞对大鼠肝癌的治疗

目的:研究低剂量环磷酸胺(Cy)联合MHC Ⅰ类限制性肿瘤抗原多肽Mutl致敏、白细胞介素2(IL-2)基因修饰的树突状细胞(DCs)对转移性肺癌小鼠的治疗作用及其免疫学机理.方法:制备小鼠骨髓来源的DCs,用转移性Lewis肺癌特异性多肽Mutl预激经IL-2基因修饰的DCs联合低剂量Cy治疗转移性肺癌小鼠.通过FACS分析其脾细胞内T淋巴细胞比例的变化,~51Cr释放法检测CTL和NK细胞杀伤活性.结果:肿瘤抗原多肽致敏、IL-2基因修饰的DCs与小剂量Cy联合后,能比单用DCs更有效地治疗转移性肺癌,小鼠脾细胞中CD8~ T细胞和NK1.1~ 细胞明显比例升高,联合治疗组诱导出的CTL杀伤活性最高.结论:以肿瘤抗原多肽冲击致敏的IL-2基因修饰的DCs联合小剂量Cy能更有效地促进荷瘤宿主免疫应答,具有显著地体内抑制肺癌转移的效果.     

双功能单抗介导CD3AK细胞对人原发性肝癌的杀伤作用

目的了解CD3AK细胞在双功能单抗介导下对人原发性肝癌(PLC)的杀伤作用.方法用二次杂交瘤方法制备得双功能单抗(GP95×CD3),将该单抗激活人淋巴细胞,分别测定后者对PLC细胞的体内外杀伤效应.结果GP95×CD3能显著提高T细胞与癌细胞的结合率,对靶细胞的杀伤具有较强的特异性.体外试验明显增加细胞毒效应,裸鼠体内试验具有显著抑制肝癌生长的作用.结论GP95×CD3在体内外均可介导CD3AK细胞对PLC的杀伤作用.     

细胞因子处理联合B7—l基因转染制备有效的肝癌疫苗

在体外用IFN-Y和TNF-。等细胞因子处理B7-1表达阳性的Hepal-6,观察其对小鼠肝癌表面MHC Class Ⅰ和ICAM-1表达的调节作用和对体内外抗肿瘤免疫反应的影响。结果发现:单独B7-1基因转染的Hepal-6的致瘤性消失,但仅能诱导部分细胞毒性和部分保护性免疫反应,而B7-1基因转染与细胞因子处理联合应用则能诱导强烈的细胞毒杀伤活性和完全的抗Hepal-6保护性免疫反应。结论B7-1共刺激分子在小鼠肝癌的表达是激活抗肿瘤免疫所必需的但不充分,而B7基因转染联合IFN-7等细胞因子处理能诱导彻底的抗肿瘤免疫反应。     

导入NKG5—SV基因增强细胞杀伤活性的研究

目的研究免疫效应蛋白NKG5的拼接异构体基因NKG5-SV导入外周血自然杀伤细胞(NK细胞)对其杀伤活性的影响.方法Percoll细胞分离液分离外周血NK细胞,流式细胞仪检测分离后CD56阳性细胞浓度.以逆转录病毒为载体将NKG5-SV基因和对照基因LacZ导入NK细胞,Northernblot检测NKG5-SV的表达,K562细胞杀伤实验检测病人NK细胞转染NKG5基因前后和正常人NK细胞的NK活性.结果Percoll分离后的淋巴细胞CD56阳性细胞为77.44%,分离前为15.88%.病人NK细胞经NKG5-SV基因转染后NKG5-SVmRNA表达增高.病人NK细胞、NK-LacZ细胞、NK-NKG5-SV细胞和正常人NK细胞对K562的杀伤活性分别为5.96%±0.38%、6.03%±0.42%(P＞0.05)、27.67%±0.18%(P＜0.01)、30.33%±0.83%(P＜0.01).结论免疫效应蛋白基因导入NK细胞,可增强NK细胞的杀伤活性.     

超声消融术对癌细胞超微结构和细胞周期的影响

目的探讨超声消融术对癌细胞超微结构和细胞周期的影响. 方法体外超声消融(42 kHz,0.22 W)Walker-256细胞,扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪分别观察细胞变化. 结果超声消融Walker-256细胞后,电镜观察发现:细胞膜破裂、细胞器紊乱不清、核染色质碎裂,提示细胞已受到严重的损伤.流式细胞仪检查发现,随着超声剂量的增大,细胞S期下降,G2 M期增加,说明细胞合成抑制,放射敏感性增加. 结论在细胞水平验证了超声消融术对癌细胞具有杀伤效应.     

CD45分子在NK细胞激活中的作用及其分子机制研究

为研究NK细胞表面分子在NK细胞激活及释放细胞园子中的作用及其机制，作者用系列粘附分子单抗、配体及基困转染细胞刺激或共刺激NK细胞．定量检测IFN-γ的分泌。结果表明，CD45分子交联可独立擞话NK细胞，CD45分子的信号传递作用对CD16分子无依赖性。随着NK细胞的成熟与分化．其表面CD45分子的表达呈现RA向RO变化的特征．而RO的交联，对NK细胞的刺激显著强于RA的交联。CD22α和CD22β基因转染细胞能显著粘附NK细胞系NK3.3(RO’)，但并不能有效刺激其产生IFN-γ。作者推测．CD45分子．尤其是CD45RO．是NK细胞表面独特的信号传递分子，通过直接激活Src家横的PTK成员．开启独立的、非CDl6分子参与的NK细胞内信号传递途径。