腺病毒介导的小鼠内皮抑素治疗胃癌的研究

目的:探讨人血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)对人脐静脉内皮细胞(human umbilican vein endothelia cell,HUVEC)增殖和凋亡的影响,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制.方法:构建pcDNA3.1-V5-HisC-Ang-1真核表达载体,并瞬时转染293细胞;取新生儿脐带经胶原酶消化等方法分离培养HUVEC;分别通过MTT比色和细胞计数法,分析Ang-1瞬时转染上清对HUVEC增殖的影响;通过流式细胞仪分析在血浆饥饿实验条件下,Ang-1对HUVEC凋亡的影响.结果:成功克隆了Ang-1基因,构建了其正义真核表达载体,并在293细胞中瞬时表达;成功进行了HUVEC的原代分离及传代培养;MTT法检测HUVEC增殖结果:只加培养液组、加空载体转染上清组、加Ang-1转染上清组HUVEC OD490值分别为0.36±0.11,0.40±0.03,0.68±0.10(P＜0.05);细胞计数法检测结果依次为:(10.13±2.06)×104,(8.7±1.73)×104,(15.03±1.98)×104(P＜0.05).流式细胞仪检测HUVEC凋亡率依次为:21%,19%和6%.结论:Ang-1能显著促进血管内皮细胞体外增殖,抑制血浆饥饿时HUVEC的凋亡.     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA对肺癌治疗的研究

目的　构建抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗相结合的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA ,并对其肺癌的体内外治疗作用进行初步研究。方法　通过Westernblot分析 ,观察携带抗肿瘤新生血管生成基因angiostatink1 5 (hA)的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA和非增殖型腺病毒对介导k1 5蛋白表达的影响 ;通过细胞病理作用及动物试验 ,比较CNHK2 0 0 hA和非增殖型腺病毒对人肺癌细胞株A5 4 9的杀伤作用及对肺癌裸鼠移植瘤的治疗作用。结果　基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能够介导hA基因在肺癌细胞内高效表达k1 5蛋白 ,其表达量高于非增殖型腺病毒Ad hA。细胞病理效应显示 ,CNHK2 0 0 hA对A5 4 9的杀伤作用明显优于Ad hA ,CNHK2 0 0 hA在感染复数 (MOI)值为 1时可完全杀伤A5 4 9细胞 ,而达到相同杀伤效应的Ad hA的MOI值为 1 0 0。动物试验显示 ,CNHK2 0 0 hA对肺癌的疗效明显好于Ad hA及肿瘤增殖型病毒ONYX 0 1 5。结论　插入了抗肿瘤新生血管生成基因hA的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA ,可明显提高hA基因的表达量 ,其在体内外的抗肺癌作用较非增殖型腺病毒Ad hA及肿瘤增殖型病毒ONYX 0 1 5进一步提高。     

基因一病毒治疗系统CNHK200-hA对肺癌治疗的研究

目的构建抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗相结合的基因一病毒治疗系统CNHK200-hA，并对其肺癌的体内外治疗作用进行初步研究。方法通过Western blot分析，观察携带抗肿瘤新生血管生成基因angiostatin k1-5(hA)的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA和非增殖型腺病毒对介导k1-5蛋白表达的影响；通过细胞病理作用及动物试验，比较CNHK200-hA和非增殖型腺病毒对人肺癌细胞株A549的杀伤作用及对肺癌裸鼠移植瘤的治疗作用。结果基因．病毒治疗系统CNHK200．hA能够介导hA基因在肺癌细胞内高效表达kl-5蛋白，其表达量高于非增殖型腺病毒Ad-hA。细胞病理效应显示，CNHK200-hA对A549的杀伤作用明显优于Ad-hA，CNHK200-hAA在感染复数(MOI)值为1时可完全杀伤A549细胞，而达到相同杀伤效应的Ad-hA的MOI值为100。动物试验显示，CNHK200-hA对肺癌的疗效明显好于Ad-hA及肿瘤增殖型病毒(ONYX-015。结论插入了抗肿瘤新生血管生成基因hA的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA，可明显提高hA基因的表达量，其在体内外的抗肺癌作用较非增殖型腺病毒Ad-hA及肿瘤增殖型病毒ONYX-015进一步提高。     

甲胎蛋白异质体对原发性肝癌早期诊断的研究

用植物凝集素亲和交叉免疫电泳自显影法检测78例原发性肝细胞癌和40例良性肝病患者血清的AFP异质体。肝癌组AFP浓度124～56000ng/ml,肝病组AFP浓度31～980ng/ml。不论是应用LCA或ConA,均可将AFP分成两种异质体,分别称之为LCA结合型(AFP-R-L)和非结合型(AFP-N-L);ConA结合型(AFP-R-C)和非结合型(AFP-N-C)。以AFP-N-L<75％或AFP-R-C<100％为界诊断肝癌,肝癌组的阳性率分别达87.2％和89.7％,而肝病组的阳性率仅为2.5％和17.5％根据通常的AFP>400ng/ml的肝癌诊断标准,肝癌组的阳性率为78.2％,肝病组的假阳性率高达20％。结合检测AFP异质体诊断肝癌(用LCA分型),阳性率提高至97.4％,假阳性率降为2.5％。     

NKG5SV基因导入对自然杀伤细胞杀伤肝癌细胞能力的影响及其机制研究

目的研究导入NKG5SV基因对NK细胞肝癌杀伤作用的影响及其机理.方法将NKG5SV和对照基因LacZ基因分别导入肝癌病人的NK细胞,K562细胞杀伤实验检测NK活性,MTT法检测不同NK细胞对肝癌细胞株和正常肝细胞株的杀伤,并进行形态学观察.DAPI荧光染色法和小片段DNA定量法检测和定量细胞凋亡.结果肝癌病人NK细胞、NK-LacZ细胞、NK-NKG5SV细胞,健康人NK细胞的NK活性(%)分别为5.96±0.38、6.03±0.42(P＞0.05)、27.67±0.18(P＜0.05)、30.33±0.83(P＜0.05).作用72?h后肝癌病人NK细胞、NK-LacZ细胞、NK-NKG5SV细胞对SMMC-7721肝癌细胞株的杀伤活性(%)分别为45±5,46±9(P＞0.05)、69±4(P＜0.01).SMMC-7721细胞的凋亡细胞数(个/高倍视野)和凋亡DNA量(μg/板)分别为1.5±0.3、1.4±0.5(P＞0.05)、1.9±0.6(P＞0.05),70±10、72±9(P＞0.05)、76±10(P＞0.05).结论NKG5SV基因导入肝癌病人的NK细胞通过增加其细胞溶解作用而提高其肿瘤杀伤能力.     

异常凝血酶原酶免疫测定法作为肝癌标志物的研究

新近越来越多的临床研究资料表明,异常凝血酶原对原发性肝细胞癌(HCC)具有相当的诊断意义。本文采用酶免疫测定法检测1026例各种良恶性疾病患者血浆异常凝血酶原,进一步探讨异常凝血酶原作为 HCC 标志物的应用价值。     

白细胞介素12融合基因联合白细胞介素2对肝癌的基因治疗

我们在肝癌基因治疗目的基因筛选的实验中发现,在大鼠肝癌模型中,IL-12的基因治疗作用最为显著[1,2],若同时联合IL-2,有望进一步提高对肝癌的治疗效果. 1.材料与方法:大鼠肝癌细胞株CBRH3由中科院细胞所谢弘教授惠赠.以质粒GCp35Ep40PN为模板,PCR分别扩增p35和p40亚基基因.以PCR产物为模板,用p40上游引物和p35下游引物再次进行PCR反应,构建mIL-12融合基因.mIL-12和hIL-2基因分别插入逆转录病毒载体GCXEXPN,命名为GCIL12EXPN和GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN.按常规方法筛选逆转录病毒载体GCIL12EXPN、GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN的PA317包装细胞株,测病毒滴度.用CBRH3建立大鼠接种肝癌模型,分为生理盐水、LacZ载体对照组和IL-2、IL-12、IL-12+IL-2治疗组,每组10只大鼠,将包装细胞株脾内注射进行治疗.方差分析结果.     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及体外初步研究

目的　构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。方法　克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1 5 ) ,命名为hA。利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中 ,通过病毒增殖试验、电镜技术、Westernblot分析、鸡胚尿囊膜试验 (CAM ) ,观察CNHK2 0 0 hA的复制情况、hA基因的表达及其对新生血管生成的抑制作用。结果　构建了一种新型的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。该治疗系统为E1b 5 5× 10 3 蛋白缺失而保留了腺病毒E1a蛋白的 5型腺病毒 ,能在肿瘤细胞内大量增殖及复制 ,而在正常细胞内增殖能力较弱 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。同时CNHK 2 0 0 hA携带人抗肿瘤新生血管生成基因hA ,能在肿瘤细胞内高效表达hA蛋白 ,其表达量高于传统基因治疗的腺病毒载体系统。电镜证实该治疗系统可在肺癌A5 49细胞株中复制及增殖。CAM试验证实该治疗系统感染肺癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论　基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能在肿瘤细胞中增殖复制 ,并明显提高hA基因的表达量 ,表达产物具有抑制新生血管形成的作用。     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因．病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin（CNHK300-mE），以肿瘤增殖病毒为载体，携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子插入腺病毒E1A基因上游，将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间，通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE，该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGⅡ中大量增殖及复制，而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d，小鼠内皮抑素的表达量为1000μg／L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制，并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。     

血清α-甘露糖苷酶活性的比色测定法

复合糖在正常的生命活动中起着十分重要的作用.体内复合糖代谢维持在一个相对恒定的状态,这种恒定状态直接取决于复合糖合成酶和分解酶之间的平衡.肿瘤时,组织和血清中复合糖的改变与糖苷酶