微量高通量细胞培养法在脑炎病毒分离中的应用

目的 建立用微量高通量、多细胞谱培养法分离未明原因脑炎患儿中病毒的方法,探讨脑炎患儿中肠道病毒的感染情况.为大量、及时分离病毒、病毒鉴定和分子流行病学研究奠定基础.方法 将8株不同的细胞接种于96孔细胞培养板中,每种细胞接种一行,细胞长成单层后孔内接种脑脊液标本,每孔5-10μl,每份标本纵向接种8孔(8种细胞系),35℃、5%CO2培养.出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)者传代培养两次.两次均出现CPE者视为细胞培养阳性,-70℃保存用于病毒鉴定.将培养物首先用肠道病毒通用引物做逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)并测序,进行初步筛查.结果 93份标本中有56份出现明显的CPE,病毒分离率为60.22%(56/93),其中在MA104细胞出现病变者40份,阳性率为43.01%.其中6份培养物的RNA用肠道病毒通用引物得到了扩增,序列测定确定为肠道病毒.结论 微量多细胞培养法具有简便、快速等特点,适合用于病毒的初步筛查.     

人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

目的利用大肠杆菌表达系统表达截短人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白,并对其抗原性进行初步鉴定。方法采用PCR扩增HCMV pp65基因961～1 686 bp(321aa-562aa)片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)菌株,十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析蛋白表达,常规镍柱法纯化目的蛋白,以ELISA法初步检测其抗原性。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,pp65抗原和全病毒抗原的P/N值分别为2.737、2.535。结论本研究成功表达截短HCMV pp65抗原,并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。     

两株不同毒力EV71全基因组序列测定及分析

目的了解济南市2008年EV71的流行和变异情况,寻求潜在的EV71毒力决定位点。方法采用分段扩增的RT-PCR方法对EV71JN200803和JN200804株的基因组全长进行扩增、测序。对两株EV71的全基因组核苷酸、氨基酸序列进行比较,对非编码区进行RNA二级结构的预测和分析,并对VP1区和全基因组进行遗传进化分析。结果 EV71JN200803和JN200804株的基因组全长分别为7 405nt和7 404nt,编码区没有核苷酸的插入和缺失,全基因组序列的组成和结构均符合肠道病毒71型的特征。JN200803和JN200804全基因组有106个核苷酸突变,编码区98个,非编码区8个,编码区多数属于同义突变,仅造成16个氨基酸突变。遗传进化分析显示,EV71JN200803和JN200804株与2008年国内其他流行株同属C4亚型的C4a进化分支,与Fuyang/17.08/1株进化关系最近。结论 2008年济南市流行的EV71属于C4a亚型,济南分离株的毒力决定位点不但具有非单一性,而且具有较为独特的济南区域特点。