轮状病毒VP4蛋白酶切片段VP5*、VP8*在原核系统中的表达

目的克隆表达轮状病毒结构蛋白VP4酶切片段VP5＊、VP8＊。方法以猴轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板,经RT—PCR方法获得VP5＊、VP8＊全长基因片段cDNA,将其重组于pET-30a表达载体,转化大肠杆菌BL21（plyss）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物做SDS—PAGE和Western—blotting检测,目的产物用镍柱纯化。结果①重组载体在IPTG诱导下,工程菌表达的两个目的蛋白主要以包涵体形式存在;②SDS—PAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致,VP5＊为60kD,VP8＊为28kD,Western—blotting检测发现两目的蛋白所带标签可与抗体反应;③镍柱纯化获得RVSA11VP5＊、VP8＊蛋白,纯度达90％。结论①构建表达载体pET-30a—VP5＊、pET-30a—VP8。;②表达、纯化VP4蛋白的VP5＊、VP8＊片段。     

肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达EV71 VP1蛋白并对其抗原性进行初步鉴定;为EV71疫苗研制奠定基础。方法采用PCR扩增EV71 VP1基因2-274aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,转化Transetta（DE3）菌株,SDS-PAGE和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;探讨目的蛋白的最佳表达条件。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,Western Blot证实其抗原性良好;该蛋白的最佳表达条件是37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导表达4 h。结论表达并鉴定了EV71 VP1抗原;本研究为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。     

EV71临床分离株BALB/c小鼠致病特点分析

目的 将肠道病毒71型(EV71)临床分离株接种小鼠观察其致病特点.方法 将6株EV71临床株分别腹腔接种1日龄BALB/c小鼠,观察小鼠表现以及脑、肺脏、骨骼肌组织病理变化;采用免疫组化和RT-PCR方法,检测组织中病毒抗原和基因片段.结果 临床分离的6株EV71(C4亚型)接种1日龄小鼠均出现病症,其中JN200804株实验小鼠症状较重,小鼠脑组织和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化;JN200804株感染组小鼠脑内检测到EV71抗原和基因片段.结论 6株EV71临床株均可感染小鼠并致病,重者出现松弛型麻痹并死亡,轻者出现震颤、麻痹但可恢复至正常.     

济南市手足口病患者肠道病毒71型的分离与鉴定

目的 从13例2008年、2009年济南市HFMD患者的粪便标本中分离获得EV71病毒并对其基因型进行鉴定.方法 按照中国疾病控制预防中心<手足口病标本采集及检测技术方案>的规定对标本中的病毒进行分离和鉴定,对VP1编码基因的部分核苷酸序列进行测序分析.结果 分离到6株EV71病毒,均与EV1 C4亚型处于同一进化树分支上,与C4亚型的核酸同源率均大于96%.结论 济南地区流行的EV71主要为C4亚型,与2008年中国流行的C4亚型EV71相比并未出现明显突变,引起重症的毒株与未引起重症的毒株相比,在VP1蛋白部分片段上没有发现明显的氨基酸差异.     

一起病毒性脑炎病因的分子生物学鉴定

目的探讨2003年山东济南地区病毒性脑炎（VE）流行病因。方法通过随机PCR及肠道病毒特异性的RT—PCR扩增获得病毒分离株特异性核酸片段，测序并进行同源性分析和多序列比对，确定病毒种类及分型。结果从患者标本中分离到5株病毒，以随机PCR获得其中1株病毒的核酸片段，经BLAST分析发现其与肠道病毒同源性最高，然后分别测得5株病毒5’端非编码区及部分VP1区核酸序列，经序列比对分析，确定5株病毒均为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇B5，并且均与2002--2004年间浙江无菌性脑膜炎流行期间分离的柯萨奇B5分离株同源性最高（95％以上）。结论柯萨奇B5是2003年济南地区VE流行的重要病因之一。     

EV71不同接种途径对BALB/c小鼠的感染特点

目的 研究EV71 JN200804株对1日龄BALB/c小鼠的感染特点,建立EV71感染BALB/c小鼠的动物模型,为疫苗和抗病毒药物的研究提供可靠的动物评价工具.方法 EV71JN200804株分别采用口服、颅内注射、肌内注射和腹腔注射感染1日龄BALB/c小鼠,出现后肢麻痹后,做后肢电生理检测;安乐动物,采集脑、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、小肠及后肢肌肉,进行动物体内的病毒分离和RT-PCR鉴定,同时对各器官组织进行组织病理学观察.结果 接种EV71后,颅内、肌内和腹腔注射组小鼠体重增长缓慢,4～5d出现后肢麻痹,7d左右死亡.RT-PCR和病毒分离表明颅内、肌内和腹腔注射组的肌肉分离到病毒,颅内注射组脊髓也分离到病毒,经RT-PCR鉴定为EV71感染.肌电图显示颅内、肌内和腹腔注射组的时限显著增加,波幅显著降低,判断小鼠后肢麻痹可能既有神经源性损害又有肌源性损害.组织病理学观察发现,颅内、肌内、腹腔注射组小脑浦肯野细胞及颗粒细胞减少,脊髓前角白质区神经纤维肿胀,后肢肌肉组织大片坏死溶解、炎性细胞浸润,肺组织明显充血,局部心肌细胞肿胀,部分肝组织内可见巨噬样细胞及淋巴样细胞浸润,部分肾皮质中肾小球萎缩、数目减少,而口服组无明显病理变化.结论 EV71 JN200804株通过颅内、肌内和腹腔注射三种途径均能感染并导致1日龄BALB/c小鼠后肢麻痹,此动物模型可用于EV71致病机制和特异性抗病毒药物的研究及疫苗的评价.     

风疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表达及条件优化

目的 为风疹病毒（RV）感染提供特异性及敏感性高的检测手段。方法采用PCR扩增RV包膜糖蛋白E1基因202—353aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,构建pET30a（＋）-E1,转化BL21（plysS）菌株,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;并探讨温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间对目的蛋白表达产量的影响。结果获得相对分子质量约为16．6kD的融合蛋白,Western Blot证明其具有良好的抗原性,并确定该蛋白在30℃、0．6mmol／L IPTG的条件下诱导表达4h可获得最佳表达量。结论本研究为RV包膜糖蛋白E1抗原纯化及应用奠定了基础,亦为研制生产高特异性和敏感性的RV检测试剂盒提供了实验依据。     

枯草芽孢杆菌芽孢佐剂免疫途径及效果的动物实验观察

目的探讨以表面展示免疫球蛋白结合蛋白功能域(FDIBP)的枯草芽孢杆菌芽孢制备的黏膜佐剂不同途径免疫的应用效果。方法分别将表面展示FDIBP的重组枯草芽孢杆菌芽孢及大肠杆菌不耐热毒素(LT)与人IgG(hIgG)作为佐剂共孵育制备疫苗,通过灌胃、滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,5周后收集外周血、肺泡、小肠及阴道冲洗液。采用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、抗hIgG特异性IgG抗体,同时检测血清及肺泡、小肠、阴道冲洗液中抗hIgG特异性IgA抗体水平。结果与无佐剂免疫者比较,枯草芽孢杆菌芽孢佐剂滴鼻能有效提高小鼠体液免疫产生的抗原特异性抗体IgA及IgG水平(P<0.01),但未能有效刺激细胞免疫上调血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平;通过灌胃途径免疫者上述特异性抗体及细胞因子水平均无显著变化(P均>0.05)。结论展示FDIBP的枯草芽孢杆菌芽孢可用作滴鼻途径黏膜疫苗佐剂,能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应。     

呼吸道合胞病毒感染兔呼吸系统组织病理学的改变和相关指数评分标准的建立

目的探讨RSV感染兔呼吸系统的组织病理学改变及其病理学指数评估方法。方法将RSV 100μL(108 TCID50/mL)鼻腔接种新西兰兔,分别于3和5 d时处死动物,取鼻黏膜、气管、肺门支气管、肺组织做石蜡包埋切片、HE染色,与正常对照组比较,显微镜下观察组织病理学改变。根据病变程度、参考相关文献,制定鼻黏膜、气管/支气管、肺组织的病理学指数评分标准并进行评分。结果与正常对照组相比,接种病毒动物可见鼻黏膜增厚甚至可见坏死脱落灶、单个核细胞浸润以及淋巴样组织增生;气管、支气管黏膜增厚、粗糙、排列紊乱,有坏死脱落,支气管内可见渗出物;肺组织以肺门部位病变显著,可见以围绕支气管或血管组织为主的炎细胞浸润灶,肺泡内、各级细支气管内存在炎性分泌物;接种RSV5 d组病理学指数评分与正常对照组相比有统计学意义。结论RSV鼻腔接种新西兰兔可致其鼻黏膜、气管、支气管及肺组织发生炎性损伤。我们制定的鼻黏膜、气管/支气管、肺组织的病理学指数评分标准适用于动物呼吸系统炎性损伤程度的评估。