EV71临床分离株BALB/c小鼠致病特点分析

目的 将肠道病毒71型(EV71)临床分离株接种小鼠观察其致病特点.方法 将6株EV71临床株分别腹腔接种1日龄BALB/c小鼠,观察小鼠表现以及脑、肺脏、骨骼肌组织病理变化;采用免疫组化和RT-PCR方法,检测组织中病毒抗原和基因片段.结果 临床分离的6株EV71(C4亚型)接种1日龄小鼠均出现病症,其中JN200804株实验小鼠症状较重,小鼠脑组织和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化;JN200804株感染组小鼠脑内检测到EV71抗原和基因片段.结论 6株EV71临床株均可感染小鼠并致病,重者出现松弛型麻痹并死亡,轻者出现震颤、麻痹但可恢复至正常.     

致敏绵羊红细胞在EV71细胞嗜性研究中的应用

目的 以致敏绵羊红细胞为工具研究肠道病毒71型（EV71）的细胞嗜性,并探讨传代培养细胞表面EV71受体表达情况。方法 EV71致敏的绵羊红细胞与传代培养细胞作用,观察不同方法处理的培养细胞吸附致敏绵羊红细胞的情况,分析EV71的细胞嗜性,并探讨培养细胞表面EV71受体的表达情况。结果 EV71致敏绵羊红细胞能吸附在人喉癌上皮细胞（Hep-2）、恒河猴胚肾细胞（MA104）的细胞表面,并且胰酶能破坏MA104的吸附功能,对Hep-2却无影响,而狗肾细胞（MDCK）与EV71致敏的绵羊红细胞未见吸附现象,这与病毒直接感染细胞结果一致。结论 该方法能直接、有效地反映病毒的细胞嗜性及培养细胞表面病毒受体的表达情况,在病毒学尤其是病毒受体研究中具有较强的可行性及应用价值。     

不同毒力EV71济南分离株全基因组序列比较分析

目的研究EV71济南分离株的基因特点,寻找潜存的EV7l毒力决定位点。方法将6株EV71济南分离株（JN200803、JN200804、Jinanl002、Jinanl004、Jinan1005和Jinan1006株）分别接种1d龄BALB／c小鼠,确定其对小鼠的致病性程度。对6株EV71全基因组核苷酸、氨基酸序列进行比较,对非编码区进行RNA二级结构的预测和分析,对VPl区进行遗传进化分析。结果通过动物实验可将6株EV71济南分离株分为强、中、弱毒力株。小鼠感染强毒株（JN200804、Jinan1002、Jinanl004、Jinanl005株）的主要症状为后肢麻痹并死亡,感染弱毒株（Jinanl006株）的主要症状为后肢麻痹但能自愈,感染无毒株（JN200803株）未引起明显症状。不同毒力EV71分离株全基因组序列比对发现,共有40个核苷酸位点的差异,导致编码区8个氨基酸突变,其中第937位氨基酸（位于2A片段）在强毒株、弱毒株和无毒株间发生了连续突变（937aa：S→C→G）。非编码区RNA二级结构预测表明,5’UTR第115位核苷酸突变对内部核糖体进入位点（IRES）的结构有较大影响。遗传进化分析显示,与同内2003年以后的流行毒株相同,6株EV71济南分离株均属C4亚型的C4a进化分支。结论全基因组序列比较分析发现不同毒力EV71济南分离株之间存在差异位点,为采用反向遗传学方法鉴定EV71毒力决定位点奠定了基础。     

济南市手足口病患者肠道病毒71型的分离与鉴定

目的 从13例2008年、2009年济南市HFMD患者的粪便标本中分离获得EV71病毒并对其基因型进行鉴定.方法 按照中国疾病控制预防中心<手足口病标本采集及检测技术方案>的规定对标本中的病毒进行分离和鉴定,对VP1编码基因的部分核苷酸序列进行测序分析.结果 分离到6株EV71病毒,均与EV1 C4亚型处于同一进化树分支上,与C4亚型的核酸同源率均大于96%.结论 济南地区流行的EV71主要为C4亚型,与2008年中国流行的C4亚型EV71相比并未出现明显突变,引起重症的毒株与未引起重症的毒株相比,在VP1蛋白部分片段上没有发现明显的氨基酸差异.     

一起病毒性脑炎病因的分子生物学鉴定

目的探讨2003年山东济南地区病毒性脑炎（VE）流行病因。方法通过随机PCR及肠道病毒特异性的RT—PCR扩增获得病毒分离株特异性核酸片段，测序并进行同源性分析和多序列比对，确定病毒种类及分型。结果从患者标本中分离到5株病毒，以随机PCR获得其中1株病毒的核酸片段，经BLAST分析发现其与肠道病毒同源性最高，然后分别测得5株病毒5’端非编码区及部分VP1区核酸序列，经序列比对分析，确定5株病毒均为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇B5，并且均与2002--2004年间浙江无菌性脑膜炎流行期间分离的柯萨奇B5分离株同源性最高（95％以上）。结论柯萨奇B5是2003年济南地区VE流行的重要病因之一。     

EV71不同接种途径对BALB/c小鼠的感染特点

目的 研究EV71 JN200804株对1日龄BALB/c小鼠的感染特点,建立EV71感染BALB/c小鼠的动物模型,为疫苗和抗病毒药物的研究提供可靠的动物评价工具.方法 EV71JN200804株分别采用口服、颅内注射、肌内注射和腹腔注射感染1日龄BALB/c小鼠,出现后肢麻痹后,做后肢电生理检测;安乐动物,采集脑、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、小肠及后肢肌肉,进行动物体内的病毒分离和RT-PCR鉴定,同时对各器官组织进行组织病理学观察.结果 接种EV71后,颅内、肌内和腹腔注射组小鼠体重增长缓慢,4～5d出现后肢麻痹,7d左右死亡.RT-PCR和病毒分离表明颅内、肌内和腹腔注射组的肌肉分离到病毒,颅内注射组脊髓也分离到病毒,经RT-PCR鉴定为EV71感染.肌电图显示颅内、肌内和腹腔注射组的时限显著增加,波幅显著降低,判断小鼠后肢麻痹可能既有神经源性损害又有肌源性损害.组织病理学观察发现,颅内、肌内、腹腔注射组小脑浦肯野细胞及颗粒细胞减少,脊髓前角白质区神经纤维肿胀,后肢肌肉组织大片坏死溶解、炎性细胞浸润,肺组织明显充血,局部心肌细胞肿胀,部分肝组织内可见巨噬样细胞及淋巴样细胞浸润,部分肾皮质中肾小球萎缩、数目减少,而口服组无明显病理变化.结论 EV71 JN200804株通过颅内、肌内和腹腔注射三种途径均能感染并导致1日龄BALB/c小鼠后肢麻痹,此动物模型可用于EV71致病机制和特异性抗病毒药物的研究及疫苗的评价.     

枯草芽孢杆菌芽孢佐剂免疫途径及效果的动物实验观察

目的探讨以表面展示免疫球蛋白结合蛋白功能域(FDIBP)的枯草芽孢杆菌芽孢制备的黏膜佐剂不同途径免疫的应用效果。方法分别将表面展示FDIBP的重组枯草芽孢杆菌芽孢及大肠杆菌不耐热毒素(LT)与人IgG(hIgG)作为佐剂共孵育制备疫苗,通过灌胃、滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,5周后收集外周血、肺泡、小肠及阴道冲洗液。采用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、抗hIgG特异性IgG抗体,同时检测血清及肺泡、小肠、阴道冲洗液中抗hIgG特异性IgA抗体水平。结果与无佐剂免疫者比较,枯草芽孢杆菌芽孢佐剂滴鼻能有效提高小鼠体液免疫产生的抗原特异性抗体IgA及IgG水平(P<0.01),但未能有效刺激细胞免疫上调血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平;通过灌胃途径免疫者上述特异性抗体及细胞因子水平均无显著变化(P均>0.05)。结论展示FDIBP的枯草芽孢杆菌芽孢可用作滴鼻途径黏膜疫苗佐剂,能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应。     

呼吸道合胞病毒感染兔呼吸系统组织病理学的改变和相关指数评分标准的建立

目的探讨RSV感染兔呼吸系统的组织病理学改变及其病理学指数评估方法。方法将RSV 100μL(108 TCID50/mL)鼻腔接种新西兰兔,分别于3和5 d时处死动物,取鼻黏膜、气管、肺门支气管、肺组织做石蜡包埋切片、HE染色,与正常对照组比较,显微镜下观察组织病理学改变。根据病变程度、参考相关文献,制定鼻黏膜、气管/支气管、肺组织的病理学指数评分标准并进行评分。结果与正常对照组相比,接种病毒动物可见鼻黏膜增厚甚至可见坏死脱落灶、单个核细胞浸润以及淋巴样组织增生;气管、支气管黏膜增厚、粗糙、排列紊乱,有坏死脱落,支气管内可见渗出物;肺组织以肺门部位病变显著,可见以围绕支气管或血管组织为主的炎细胞浸润灶,肺泡内、各级细支气管内存在炎性分泌物;接种RSV5 d组病理学指数评分与正常对照组相比有统计学意义。结论RSV鼻腔接种新西兰兔可致其鼻黏膜、气管、支气管及肺组织发生炎性损伤。我们制定的鼻黏膜、气管/支气管、肺组织的病理学指数评分标准适用于动物呼吸系统炎性损伤程度的评估。     

真菌提取物JN219抗轮状病毒机制的研究

目的探讨真菌提取物JN219抑制轮状病毒（RV）入侵宿主细胞的机制。方法构建原核表达载体pET-30a-VP4,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达并用His抗体镍柱亲和层析纯化病毒外壳蛋白VP4,利用体外竞争抑制RV—MA104细胞感染模型,观察与VP4共孵育后含JN219提取物抑制RV活性的变化。结果构建的pET-30a—VP4载体可表达VP4重组蛋白（约88kD）,镍柱纯化的VP4蛋白含量为0．75mg／ml,与VP4作用后JN219提取物抗病毒指数由36．7降低为9．1,半数有效浓度由（0．163±0．02）mg／ml升为（0．702±0．13）mg／ml,半数中毒浓度由5．99mg／ml升至6．38mg／ml,P均〈0．05。结论与病毒外壳蛋白VP4结合,进而阻断病毒穿入细胞可能是JN219抗RV的主要机制之一。