人外周血单核细胞来源树突状细胞转染重组腺相关病毒诱导特异性T细胞的效应

目的:观察人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含前列腺特异性抗原片段的重组腺相关病毒后,其所诱导的特异性T细胞对前列腺癌细胞株LNCaP和DU145的体外杀伤抑制作用。方法:实验于2006-05/10在南方医院肿瘤科生物室完成。①对象:HLA-A2基因亚型的健康自愿供血者1名,对本实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。作为靶细胞的前列腺癌细胞株LNCaP、DU145以及携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒由美国阿肯色大学生物治疗中心刘勇教授惠赠。②实验方法:抽取HLA表型为A2的健康自愿供血者外周血50mL,Ficoll法分离单核细胞体外培养,磷酸盐缓冲液洗涤6孔板,收集悬浮细胞作为效应T细胞,贴壁细胞即为树突状细胞。向6孔板内加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒,第4天加入白细胞介素4,第6天加入肿瘤坏死因子α,至培养第7天收获悬浮细胞即为成熟的树突状细胞。③实验评估:应用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子标记的表达。以ELISA法检测树突状细胞分泌白细胞介素12的含量。将成熟树突状细胞与效应T细胞分别按1:10、1:20、1:40进行共培养,将未经过树突状细胞共育的T细胞设置为空白对照组,ELISA法检测效应T细胞分泌干扰素γ的含量。LNCaP、DU145靶细胞分别与效应T细胞按效靶比5:1、10:1、20:1、40:1进行共培养,MTT法检测效应T细胞对两种靶细胞的杀伤作用。结果:①树突状细胞表面分子标记的表达:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒致敏后的树突状细胞,培养8d后高表达CD83.CD40.HLA-DR,CD80,CD1a,CD86,分别为65.8%,66.0%,96.7%,70.0%,61.9%.79.0%。②树突状细胞释放白细胞介素12含量检测:与培养第1天比较,第7天成熟树突状细胞释放白细胞介素12的含量显著升高(P<0.05)。③效应T细胞释放干扰素γ含量检测:与空白对照组比较,树突状细胞:T细胞按1:10、1:20、1:40共培养后所释放的干扰素γ含量均明显升高(P<0.01.0.01,0.05),且随树突状细胞加入比例的提高有所增加。④效应T细胞的细胞毒性作用检测:效应T细胞可有效识别并杀伤HLA-A2阳性的LNCaP细胞,其抑制作用在效靶比为10:1、20:1、40:1时均显著强于DU145细胞株(P<0.01)。结论:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒转染后的树突状细胞,其细胞表型和刺激淋巴细胞增殖、分化的功能无明显改变,可诱导自体效应T细胞增殖,该效应T细胞对LNCaP细胞具有明显杀伤作用。     

rAAV-AFP转染人外周血单核细胞来源树突状细胞增强免疫刺激功能

目的:探讨表达甲胎蛋白抗原的重组腺相关病毒rAAV-AFP转染对人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)免疫刺激功能的影响．方法:用rAAV-AFP转染新分离的DC;苔盼蓝拒染法检测每天的活细胞比率;流式细胞仪检测DC表面分子CD80,CD86,CD83,CD40, CD1a,HLA-DR及AFP的表达;并用3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激自体淋巴细胞增殖能力;MTT法检测DC诱导T细胞的杀伤活性．结果:成熟DC 77．7％表达AFP蛋白;转染对活细胞百分率和成熟DC表型无影响,与未转染组无显著差异(P>0．05);转染后DC仍保持较强的刺激自体淋巴细胞增殖的能力,与未转染组也无显著性差异(P>0．05),并且可诱导出特异性杀伤,效应细胞和靶细胞为80:1,40:1,20:1 时,与未转染组相比均有显著差异(35．5±5．5 vs 20．6±4．7;28．7±3．6 vs 15.3±2．5;16．2±2．8 vs 9．6±1．8;均P<0．01)．结论:rAAV可负载AFP基因在DC中表达, rAAV-AFP转染DC对其功能无明显影响,免疫功能更强．     

组织多肽特异性抗原在乳腺癌中的临床研究

目的研究血清组织多肽特异性抗原(TPS)在乳腺癌患者血清中的表达水平及其对乳腺癌的临床应用价值。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定30例健康体检者、40例乳腺良性病变患者和90例乳腺癌患者的血清TPS和CA153水平。结果乳腺癌患者的血清TPS和CA153水平及检测阳性率均明显高于乳腺良性疾病和正常对照组(P<0.01)。TPS和CA153阳性率和浓度均随着临床分期的进展而升高,而TPS在临床期也有高水平表达。TPS对乳腺癌骨转移最为敏感,远处淋巴结的乳腺癌患者水平最高(P<0.05)。乳腺癌患者治疗有效后血清TPS和CA153水平均明显下降(P<0.05),尤其以TPS下降幅度较为显著(P<0.05)。结论TPS是诊断乳腺癌的一项敏感性强的肿瘤标志物,尤其是骨转移患者,对乳腺癌诊断、病情判断和疗效评价等均有重要价值。     

rAAV/BA46转染树突状细胞诱导特异细胞免疫

目的 探讨以腺相关病毒为载体,乳腺癌抗原BA46基因转染树突状细胞(DC)诱导特异细胞免疫的可行性.方法 取健康人外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞),将细胞分为基冈转染组及对照组,基因转染组以重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo转染,对照组以293细胞裂解物冲击.两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC前体细胞成熟.第7天,收集DC,取该DC与T细胞按比例混合,诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用3H-TdR掺入法检测DC刺激自体淋巴细胞增殖能力;以流式细胞仪分析CTL细胞中IFN-γ、IL-4、CD4、CD8、CD25、CD69的表达情况,同时取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞,采用51Cr释放法检测杀伤效率.结果 BA46基凶转染组DC具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力,所诱导的CTL高表达CD8、CD69和IFN-γ,对BA46阳性的靶细胞有较强的杀伤作用,该杀伤具有BA46抗原特异性和MHC限制性.结论 乳腺癌BA46基因转染DC成功诱导特异的细胞免疫.为基因修饰细胞治疗乳腺癌打下实验室基础.     

多西紫杉醇联合卡铂治疗激素抵抗性前列腺癌近期疗效观察

目的:探讨多西紫杉醇联合卡铂治疗激素抵抗性前列腺癌的应用价值。方法:12例前列腺癌患者,全部经去势手术及不同程度的抗雄激素药物治疗,经全身骨扫描证实均有多发性骨转移灶,颈部淋巴结转移和肝转移各1例,血PSA呈逐渐上升趋势。给予多西紫杉醇75mg/m2,第一天;卡铂AUC5(300～400 mg/m2),第一天;21—28天为一个周期。结果:12例随访2～26个月,平均17个月。入组后接受治疗1～6个周期。3例患者PSA值降至正常水平<4ng/ml,7例PSA值下降超过50%,有效率83.3%,有效患者PSA从治疗前(67.8±35.9ng/ml)下降至(14.2±5.7ng/ml),有效持续时间6～19个月,平均15.1个月。中位生存期为17.8个月。最常见的毒副反应为骨髓抑制,其余反应均可耐受。结论:多西紫杉醇联合卡铂治疗激素抵抗性前列腺癌有较好疗效,毒副反应可以耐受。     

乙酰肝素酶、肝细胞生长因子和血管内皮生长因子在非小细胞肺癌组织中的表达及其相关性

目的:研究乙酰肝素酶(HPA)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与临床特征之间的关系;并分析三者表达的相关性。方法:采用免疫组织化学检测45例非小细胞肺癌组织及10例正常组织中HPA、HGF及VEGF的表达水平。结果:非小细胞肺癌组织中HPA、VEGF的表达与正常组织表达、TNM分期有关。HGF的表达与正常组织的表达有关。三者中任意两者间在非小细胞肺癌组织中的表达均呈正相关性。结论:HPA、HGF与VEGF参与了非小细胞肺癌的发生、发展、浸润与转移;在非小细胞肺癌的发展过程中,三者之间可能存在协同作用。     

89SrCl2和/或骨膦治疗多发性骨转移癌的临床研究

目的评价89SrCl2、骨膦以及两者联合应用于治疗多发性骨转移癌的疗效.方法以147例恶性肿瘤并多发性骨转移患者为观察对象,其中89SrCl2治疗组59例、骨膦治疗组56例、89SrCl2和骨膦联合治疗组32例,所有病例均随访观察3个月.结果89SrCl2治疗组和骨膦治疗组对骨痛缓解总有效率分别为81.4%和80.4%,对骨病变有效率分别为17%和9%,生活质量改善率分别为49.2%和44.6%,两组3个指标比较均无显著性差异(P＞0.05).而联合应用89SrC12和骨膦治疗组镇痛总有效率为90.6%,与前两组相比无显著性差异(P＞0.05),对骨病变有效率和生活质量改善率分别为46.9%和75%,与前两组比较均有显著性差异(P＞0.05).3组病例毒副作用均较小.结论89SrC12和骨膦均对骨转移癌在镇痛及提高生活质量方面有较好疗效,联合应用89SrC12和骨膦可能会进一步提高疗效,且毒副作用无明显增加.     

腺相关病毒载体介导乳腺癌BA46基因转移的实验研究

目的　评价腺相关病毒 (AAV)为载体介导乳腺癌BA4 6基因转导树突状细胞 (DC)的可行性。方法　构建重组质粒d16 95 /BA4 6 p5/NeoSV40 (简称rAAV/BA4 6 /Neo) ,并制备该病毒。分离外周血单核细胞 (DC前体细胞 ) ,采用GM CSF、IL 4、TNF α诱导 ,以rAAV/BA4 6 /Neo病毒感染DC前体细胞 ,感染后 72h ,流式细胞仪检测rAAV/BA4 6 /Neo病毒感染效率及BA4 6表达情况 ,6d后 ,RT PCR分析BA4 6mRNA转录情况 ,PCR/Southernblot分析BA4 6基因染色体整合情况。结果　AAV成功介导BA4 6基因转导DC ,BA4 6在DC内良好表达 ,病毒基因整合入DC基因组内。结论　AAV载体成功介导BA4 6基因转导DC ,为以DC为基础的乳腺癌的基因治疗打下基础。     

Her2/neu蛋白基因重组腺相关病毒转染树突状细胞的初步探讨

目的 用Her2／neu蛋白基因重组腺相关病毒(rAAV-Her-2／neu)转染人外周血中树突状细胞(dendritic cell,DC),并鉴定其表面分子的表达,及同种混合淋巴细胞反应。方法 采用Fieol分离人外周血中的单个核细胞,在6孔板上培养。细胞分2组,分别加入病毒液和293细胞冻溶液。流式细胞仪检测DC表面标志。应用MTT法检测同种混合淋巴细胞反应。结果 两组细胞均高表达CD80,CD83,CD86,HLA-DR,较低表达CDla,CD40,两组无明显差异(P＞0．05)。结论 rAAV-Her-2／neu转染DC刺激T细胞增殖能力明显高于非转染组DC(P＞0．05)。