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11.
靶向X区的siRNA抑制乙型肝炎病毒基因的表达和复制 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)X基因的siRNA表达载体,观察其对HBV基因表达和复制的影响。方法设计并合成针对HBVX区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆人pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG22.2.15细胞,潮霉素抗性筛选获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测靶基因mRNA的抑制效果,荧光定量PCR检测HBVDNA。结果成功构建了针对HBVX基因的siRNA表达载体pSUPER-X1和pSUPER-X2,两种siRNA均能明显抑制HepG22.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为97%和88%,RT-PCR结果显示HBV的mRNA表达降低,荧光定量PCR结果证实siRNA能降低HBVDNA拷贝数2个数量级。结论载体产生的针对HBVX基因的siRNA能高效、特异地抑制HBV基因的表达和复制。 相似文献
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目的:构建针对HER2/neu的RNA干涉载体,观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响. 方法:设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链,退火互补成双链,克隆至pSUPER质粒载体,转化DH5α菌株,提取质粒,转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPC-A-1,RT-PCR检测HER2/neu的mRNA表达,Western blot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达,FCM分析细胞周期变化,MTT法观察细胞生长. 结果:肺腺癌细胞系SPC-A-1存在HER2/neu过表达;成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPER-siHER2;瞬时转染SPC-A-1细胞,HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低;G1期细胞较亲代增加9.9%;肿瘤细胞增殖速度减慢(P<0.05). 结论:成功构建了HER2/neu RNA干涉载体,转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPC-A-1 HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达,阻滞转染细胞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段. 相似文献
16.
目的:构建靶向人ClC-2基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体。方法:根据DEQOR提供的siRNA设计原则和程序,设计两个靶向ClC-2基因的发夹状siRNA;通过化学合成的方法合成两对分别互补的寡核苷酸链,退火后得到编码该siRNA的ClC-2基因片段。将该片段连接至经BglⅡ和HindⅢ双酶切的真核细胞表达载体pSUPER.puro的多克隆位点,转化扩增提取质粒;对重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。脂质体Lipofectamine^TM2000介导瞬时转染,通过RT-PCR检测人胶质瘤细胞系BT-325细胞中ClC-2mRNA表达。结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与真核细胞表达载体pSUPER.puro连接正确。转染两重组质粒细胞的ClC-2mRNA表达明显降低。结论:成功构建人ClC-2基因干扰真核表达载体2个。分别命名为pSUPER.puro-siClC-21和pSUPER.puro-siClC-22,可用于进一步研究ClC-2基因对人胶质瘤侵袭和迁移活动的影响。 相似文献
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背景与目的:30%NSCLC存在HER2/neu过表达,与肿瘤发生、转移、肿瘤血管形成、抗凋亡及化疗耐药等有关。本文通过RNA干涉抑制肺腺癌细胞SPC—A-1 HER2/neu过表达,观察肿瘤细胞周期、增殖及集落形成能力的变化。方法:构建针对HER2/neu的siRNA重组质粒,稳定转染SPC—A-1,通过RT—PCR和Western Blot检测HER2/neu表达;FCM分析细胞周期;MTT法观察细胞增殖,绘制细胞生长曲线;平板集落形成实验检测肿瘤细胞的集落形成能力。结果:成功构建了HER2/neu的siRNA重组质粒,稳定转染靶细胞后可显著降低HER2/neu表达;与亲代细胞相比,G0/G1期细胞增加17.1%,S期细胞减少12.8%;细胞生长速度减慢,集落S1抑制率达到49.0%。结论:针对HER2/neu的siRNA可以显著降低肺腺癌细胞过表达HER2/neu,肿瘤细胞阻滞于G0/G1期,造成细胞增殖减慢,集落形成能力明显下降。因此,siRNA对过表达HER2/neu肺癌的治疗具有潜在应用价值。 相似文献
19.
抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究将构建的抗人CD3单链抗体基因,克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导表达GST-ScFv融合蛋白,并以SDS-PAGE分析,在Mr为52000左右出现一条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的40%。经初步纯化和复性后,用GST亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗人CD3ScFv,竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有CD3亲和活性 相似文献
20.
子宫肌瘤(myoma of uteras)是女性生殖器最常见的良性肿瘤,多见于30~50岁妇女,因很多患者无症状,或因肌瘤很小,因此往往是在体检过程中发现,其中有许多患者由于对子宫肌瘤性质的不了解而产生紧张、恐惧、抑郁情绪,这种情绪严重影响了患者正常的社会活动功能,加之对是否选择手术疗法的顾虑,更使患者加重了心理负担,从而使生活质量下降,我们采用社会功能缺陷量表(SDSS)对180例子宫肌瘤患者进行社会功能缺陷筛选量表评定,并观察万拉法新药物治疗后社会功能改善的情况. 相似文献