人白细胞介素33基因的克隆表达及其生物学活性的研究

目的:克隆人白细胞介素33(human interleukin-33,hIL-33)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株,并对纯化的蛋白进行生物活性的初步测定.方法:采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术从人成纤维细胞总RNA中反转录并扩增得到人的成熟肽IL-33基因;采用基因克隆技术,构建PQE30-IL33重组质粒;采用Ni2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白;应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导产生的IL-4和IL-5.结果:SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的25%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,纯化后纯度达到95%以上.表达的重组蛋白IL-33促进人外周血单个核细胞产生IL-4和IL-5,浓度分别达到(106±2.6)pg/ml和(1 220±10.4)pg/ml,而未刺激对照组的浓度只有(32.2±2.3)pg/ml和(67.3±2.5)pg/ml.结论:成功构建出hIL-33的原核表达载体,诱导产生蛋白能诱导IL-4和IL-5细胞因子的产生.     

基于微小RNA的乙肝病毒RNA干扰表达载体的构建

目的为优化RNA干扰研究方法，构建了基于微小RNA的乙肝病毒RNA干扰表达载体。方法利用网络工具设计针对乙型肝炎病毒S区的靶干扰序列，将单链寡核苷酸退火形成双链，克隆人pcDNA6．2-GW／EmGFP—miR表达载体。结果经酶切及测序鉴定，插入序列与靶序列一致，载体构建正确。结论成功构建了新型乙肝病毒RNA干扰表达载体，为进一步体外及体内实验奠定了基础。     

IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤快速杀伤效应的影响

目的 :建立体外培养系统 ( CCs) ,应用 rh IL- 1 8在 CCs中诱导肿瘤快速杀伤效应 ,探讨IFN- γ在快速杀伤效应中的作用。方法 :采用 Stem Sep TM免疫磁性细胞分离法分离人外周血 NK细胞、T细胞及树突状细胞 ( DCs) ;流式细胞仪分析细胞表型 ;细胞毒实验检测杀伤活性 ;ELISA方法检测 IFN-γ的产生量。结果 :在 CCs中 ,rh IL- 1 8能单独诱导一种快速肿瘤杀伤作用 ,其杀伤作用随rh IL- 1 8浓度的增加而增高 ;rh IL- 1 8能够诱导 CCs产生 IFN-γ,并促进 m RNA的表达 ,但其作用不如 rh IL- 1 2 + rh IL- 1 8明显 ;抗 IFN- γ单抗对 rh IL- 1 8诱导的快速肿瘤杀伤效应无明显影响。结论 :IL- 1 8能够在 CCs中有效地诱导快速肿瘤杀伤效应 ,且这种杀伤效应不依赖 IFN- γ无关途径     

人肝细胞生长因子基因表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株的影响及其机制

目的：探讨人肝细胞生长因子(hHGF) 基因的表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株（CFSC-2G）生物学效应的影响及其对CCl4损伤的人正常肝细胞株（HL-7702）的保护作用,进一步探讨凋亡产生的机制。方法：将获得的稳定转染HL-7702细胞克隆,分为4组,Ⅰ组为转染PCI-neo-hHGF实验组,Ⅱ组为转染PCI-neo空载体对照组,Ⅲ组为仅加入脂质体的对照组,Ⅳ组为空白对照组。采用MTT法测定细胞增殖活性。采用Western blotting测定转染PCI-neo-hHGF的HL-7702细胞和CFSC-2G细胞中hHGF、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白质的表达。结果：HL-7702细胞转染PCI-neo-HGF并培养48 h后,细胞的增殖活性明显高于PCI-neo空载体对照组、脂质体转染对照组和空白对照组HL-7702细胞（P<0.01）,而且随着转染PCI-neo-HGF剂量增加,细胞的增殖活性有一定的增长趋势,但各组间比较差异无显著性（P>0.05）;PCI-neo-HGF转染的HL-7702细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4损伤的HL-7702细胞和PCI-neo转染的HL-7702细胞明显降低,未检测到caspase-8和caspase-9蛋白质的表达;PCI-neo-HGF转染的CFSC-2G细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4诱导的CFSC-2G增加,caspase-9蛋白质表达也呈阳性。结论：PCI-neo-HGF可促进体外培养的HL-7702细胞的生长增殖,能够抑制CCl4损伤的HL-7702细胞的凋亡,促进大鼠CFSC-2G细胞的凋亡,其作用机制可能与上调caspase-3和caspase-9蛋白质表达有关。     

阿德福韦酯对乙型肝炎肝硬化患者的治疗效果评价

目的：观察阿德福韦酯治疗后乙型肝炎肝硬化患者乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙肝肝炎病毒DNA(HBV DNA)阴转率和child-Pugh分级的变化,评价其对乙型肝炎肝硬化的治疗效果。方法：选择乙肝肝硬化的患者197例,按患者意愿分为治疗组和对照组,其中治疗组101例（男性88例,女性13例）,对照组96例(男性84例,女12例),治疗前两组在年龄、性别、病程、Child-Pugh分级构成方面差异无显著性。两组均给予支持治疗,治疗组同时给予阿德福韦酯,1次?d-1,每次10 mg口服,观察2年。结果：治疗组HBeAg转阴率治疗1年为28.7%,治疗2年为49.5%;HBV DNA转阴率治疗1年为60.3%,治疗2年为84.2%,均明显高于对照组HBeAg转阴率(治疗1年为8.0%,治疗2年为11.6%)和HBV DNA转阴率(治疗1年为9.1%,治疗2年为13.0%)（P<0.05）。治疗组患者Child-Pugh分级治疗前为A级19例,B级52例,C级30例;治疗2年后为A级24例,B级66例,C级11例。对照组患者治疗前为A级16例,B级53例,C级27例,治疗2年后为A级13,B级48例,C级35例。治疗组治疗2年后Child-Pugh分级A、B级患者所占构成比明显高于对照组（P<0.05）。治疗组治疗2年后6例死于并发症,对照组19例死于并发症,两组病死率比较差异有显著性（P<0.05）。治疗组患者治疗后Child-Pugh分级A、B级患者所占构成比高于治疗前（P<0.05）,对照组患者Child-Pugh 分级A、B级患者所占构成比治疗前后比较差异无显著性（P>0.05）。 结论：阿德福韦酯能明显抑制乙型肝炎肝硬化患者HBV的复制,明显提高HBeAg阴转率,延长生存期,明显降低病死率。     

降脂酮对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤的保护作用

目的：观察降脂酮对四氯化碳（CCl₄）诱导的慢性肝损伤的保护作用及其作用机制。方法：建立CCl₄慢性肝损伤动物模型,大鼠72只随机分为6组（每组12只）,分别设为空白对照组以及CCl₄慢性肝损伤模型组（简称模型组）、阳性药对照组及降脂酮低、中和高剂量组（50、100和200 mg•kg^-1•d^-1）。测定大鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）。肝组织中过氧化氢酶（CAT）活性及各胱甘肽（GSH）含量。结果：与模型组比较,降脂酮低、中和高剂量组血清ALT、AST活性均明显降低（P<0.05或P<0.01）,肝组织CAT活性及GSH含量显著升高（P<0.05或P<0.01）;与阳性药对照组比较,降脂酮高剂量组ALT活性明显降低（P<0.01）,低、中剂量组ALT活性与阳性对照组比较差异均无显著性（P>0.05）;3个剂量组中,降脂酮高剂量组ALT活性低于低、中剂量组（P<0.05）,低、中剂量之间比较差异无显著性（P>0.05）,中、高剂量组AST活性较低剂量组均明显降低（P<0.05）。结论：降脂酮对CCl₄所致大鼠慢性肝损伤具有保护作用,其机制可能与抗氧化的作用有关。     

去氢表雄酮及其代谢产物对人肿瘤细胞系的抗增殖作用

目的: 研究去氢表雄酮（DHEA）及其代谢物去氢表雄酮硫酸酯（DHEAs）对HepG2和HT-29细胞增殖的抑制作用及其机制。方法: HepG2和HT-29细胞分别分为对照组、不同浓度（1、 10、 50、 100及200 μmol•L^-1）DHEA组和DHEAs组，孵育8、24、48及72　h后，分别采用噻唑蓝（MTT）比色法和BrdU 测定法检测DHEA对肿瘤细胞的生长抑制率，同时测定3-羟基-3-甲基戊二酸单酰A还原酶（HMGR）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）及乳酸脱氢酶（LDH）活性。结果： ①MTT法结果显示，与对照组比较，不同浓度DHEA组HepG2和HT-29细胞增殖抑制率均显著增加（P<0.05）。作用24 h时，100 μmol•L^-1DHEA组细胞增殖抑制率降低最显著（P<0.05），而DHEAs组差异无显著性（P>0.05）。②BrdU法结果显示，当DHEA浓度在50、100和200 μmol•L^-1时细胞的生长均显著受到抑制，尤其以HepG2细胞的生长抑制率最高（P<0.05）。③DHEA对HepG2细胞HMGR活性抑制率为62%，对HT-29细胞HMGR活性抑制率为51％，而 DHEAs则无明显作用。④100 μmol•L^-1DHEA抑制G6PD的效力为85%，而DHEAs的抑制效力仅为6%。⑤DHEA和DHEAs对细胞LDH的活性影响组间比较差异无显著性（P>0.05）。结论：DHEA对HepG2和HT-29两种肿瘤细胞系均具有较强的抗增殖作用，能明显降低细胞的G6PD或HMGR活性，DHEAs则无明显作用。     

体外培养系统中IL-18诱导的快速肿瘤杀伤效应影响因素的研究

目的：应用rhIL-18在体外培养系统(Coculture system in vitro，CCs)中诱导快速肿瘤杀伤效应，并对这种快速杀伤效应的影响因素进行了探讨。方法：采用Stem Sep^TM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突状细胞(DCs)，流式细胞仪分析细胞表型，^125I-UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性。结果：rhIL-18在CCs中能够诱导快速肿瘤杀伤效应，这种杀伤效应与rhIL-18含量呈剂量依赖关系，DCs和T细胞的存在与否对这种杀伤效应无明显影响，同时这种快速杀伤效应无抗原特异性、不受MHC的限制。结论：在体外培养系统中只要有rhIL-18和NK细胞的存在，即能产生对肿瘤细胞的快速杀伤效应，即这种快速杀伤效应细胞为NK细胞。     

DHEA抑制大鼠转移性Morris肝癌的实验研究

目的：探讨去氢表雄酮（DHEA）的体内抗癌作用及其机制。 方法：Buffalo大鼠21只随机分为空白对照组(n=5);肿瘤对照组（把Morris肝细胞瘤移植到大鼠的两肋皮下,建立Morris 肝细胞瘤移植的Buffalo大鼠的体内模型）,喂养基础饲料(n=6)、DHEA肿瘤组（建立Morris肝细胞瘤移植模型后,在喂养的基础饲料中添加DHEA）(n=6)和去氢表雄酮硫酸酯（DHEA-s）肿瘤组（建立Morris肝细胞瘤移植模型后,在喂养的基础饲料中添加DHEA-s）(n=4)。分别喂养4周后,应用流式细胞术检测大鼠的免疫功能,应用磁场型高分解能质量分析仪（GC/MS）方法测定大鼠体内类固醇的含量,采用免疫组化方法染色检测磷酸化的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN）蛋白表达,同时测定其对大鼠的毒副作用。 结果：DHEA肿瘤组的瘤重量［(8.31±0.61)g］较肿瘤对照组［(14.57±0.56)g］显著减小,抑制率达到43%。免疫组织化学染色显示DHEA肿瘤组的磷酸化PTEN蛋白表达量增加,同时提高了CD3、CD4阳性细胞百分率及CD4+/CD8+比值,与肿瘤对照组相比差异有显著性（P<0.05）。DHEA肿瘤组的胆固醇、甘油三脂及高密度脂蛋白的含量与空白对照组相比差异无显著性,未见其有毒副作用。 结论：DHEA对肿瘤具有明显的抑制作用,此作用是通过提高PTEN的蛋白表达和免疫功能来完成的。