运用酵母双杂交技术筛选LRRK2相互作用蛋白

目的:使用酵母双杂交来筛选LRRK2基因的相互作用蛋白,以研究其功能.方法:使用的诱饵片段包含MAPKKK和ROC功能域的一部分与COR功能域的全长.诱饵片段由聚合酶链式反应(PCR)扩增后连入酵母表达质粒pGBKT7,pGBKT7-bait质粒经测序验证后转化酵母茵株AH109,用免疫印迹来检验该质粒在酵母中的表达,人类胎脑cDNA文库被转化到能稳定表达诱饵蛋白的酵母菌株中,并铺到含有x-a-gal的四缺(SD/-Trp/-ku/-His/-Ade)的培养皿上.分别使用含有pGBKT7或pGBKT7-bait的AH109酵母菌株进行回交检测,进一步确证从初步筛选中获得的阳性克隆,并用生物信息学来分析其中的文库质粒.结果:获得9个真阳性的克隆,经生物信息学分析其中有3个克隆中的序列不在已知基因的开放阅读框内.其余6个克隆中的序列在以下几个已知基因的开放阅读框中:STRBP,BAGS,PTPN23,L3 MBTL3,RALYL,KIAA1783.结论:经酵母双杂交后成功地获得了真阳性克隆.这些相互作用蛋白将为研究LRRK2的功能、帕金森病发病机制和其他神经性疾病提供一些新的线索.     

运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断

目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.     

肝细胞核因子-1α基因A1a98 Val变异与中国汉族迟发型2型糖尿病的关系

目的 :探讨肝细胞核因子 1α(HNF 1α)基因外显子 1Ala98Val变异是否与中国汉族迟发型 2型糖尿病相关。方法 :选择中国汉族 15 0例迟发型 2型糖尿病患者及 15 5例正常对照者 ,应用聚合酶链反应———限制性片段长度多态 (PCR SSCP)及直接测序法检测Ala98Val变异。结果 :受检者均不存在Ala98Val变异。结论 :Ala98Val变异不是引起中国汉族迟发型 2型糖尿病的重要遗传因素。     

中国迟发型2型糖尿病患者葡萄糖激酶基因突变研究

目的 :探讨中国迟发型 2型糖尿病患者葡萄糖激酶 ( glucokinase ,GCK)基因的突变情况。方法 :收集了中国汉族 47个迟发型 2型糖尿病 (late onsetType 2diabetes)家系 ,应用多聚酶链反应 单链构像多态性 ( polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,PCR SSCP)的分析方法 ,对先证者GCK基因 12个外显子进行突变检测。结果 :6 ,9号外显子SSCP电泳时 ,出现异常电泳条带。测序证实在 6号内含子 38bp处发生C→T的单个碱基改变 ,变异基因频率为 35 .1%;9号内含子 8bp处发生C→T的单个碱基改变 ,变异基因频率为5 7.5 %。结论 :发现了中国人两个单核苷酸多态位点 :IVS6%D 38C→T ;IVS9%D 8C→T。GCK基因突变不是中国汉族迟发型 2型糖尿病的主要致病原因。     

黄芪对TGF-β1致人腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的 :探讨黄芪对腹膜纤维化的作用及可能机制。方法 :人腹膜间皮细胞 (HPMC)作体外培养 ,在第三代 ,将细胞转板至细胞融合后 ,将其分为对照组 (F12 ) ,TGF β1组 (F12 +TGF β15ng/ml) ,TGF β1加黄芪 1组(F12加TGF β1加黄芪 ,黄芪终浓度为 10 0 μg/ml,TGF β1加黄芪 2组 (F12加TGF β1加黄芪 ,黄芪终浓度为 1mg/ml) ,分别在 2 4,48h采用ELISA法检测上清液中纤维连接蛋白 (FN)和纤溶酶原抑制剂 (PAI 1)的含量 ;FNmRNA ,PAI 1mRNA和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA的表达采用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)检测。结果 :①HPMC表达FN ,PAI 1和bFGF ;②HPMC在 5ng/mlTGF β1刺激下分泌FN及PAI 1明显的增加 ,与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;③HPMC在TGF β1和不同浓度的黄芪刺激后 ,在 2 4h内可使FN及PAI 1减少 ,尤其是PAI 1与TGF β1组比差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。④HPMC经TGF β1作用 12h后 ,FNmRNA ,PAI 1mRNA和bFGFmRNA半定量结果与对照组相比 ,其表达量分别上调 18.5 4%,8.6 %和 6 6 .9%,HPMC经 10 0μg/ml和 1mg/ml黄芪作用 12h后FN ,PAI 1和bFGFmRNA的表达与TGF β1组比较均下调 ,其结果分别为5 .3 %,1.3%,3 .8%和 5 .4%,74.3 %,2 3 .7%。结论 :TGF β1可促进HPMC合成     

肝细胞核因子—1α基因A1a98Val变异与中国汉族迟发型2型糖尿病的关系

目的：探讨肝细胞核因子—1α(HNF—1α)基因外显子1 A1a98Val变弄是否与中国汉族迟发型2型糖尿病相关。方法：选择中国汉族150例迟发型2型糖尿病患者及155例正常对照者，应用聚合酶链反应——限制性片段长度多态(PCR—SSCP)及直接测序法检测A1a98Val变异。结果：受检者均不存在Ala98Val变异。结论：A1a98Val变异不是引起中国汉族迟发型2型糖尿病的重要遗传因素。     

血管内皮生长因子基因在成人肝组织中的表达

血管内皮生长因子 (ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ)是一类具有高度特异性的促血管内皮细胞分裂原 ,通过促进新生血管的形成 ,参与胚胎发育、创伤组织的修复、缺血、炎症及肿瘤的发生等多种病理生理过程[1] 。但在正常组织中 ＶＥＧＦ 基因的表达 ,文献报道较少。为此 ,本研究通过了解其在正常成人肝脏组织中的表达 ,探讨ＶＥＧＦ的基因表达调控及其生物学意义。1　材料与方法1 1　材料　正常成人肝ｃＤＮＡ文库 (美国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司产品 ) ;ＴａｑＤＮＡ聚合酶 ,10×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ,2 5ｍＭＭｇＣｌ2 ,10ｍＭｄＮＴＰ(Ｔａｋａｒａ公司产品 )     

嵌合体真两性畸形两例的遗传学研究

病例1 血351号、30岁、社会性别女,自幼外阴部畸形。20岁以后喉结稍隆起,小阴茎日趋变粗,左侧阴囊内睾丸长大。一直无月经。体查:身高156厘米、面部少许胡须,喉结稍突出,乳房稍发育。外阴倾向于男性,阴茎头发育可,尿道开口于会阴部,左侧阴囊内可扪及鸽蛋大小之睾丸,右侧阴囊隆起可触及疝囊,无阴道。手术探查 盆腔内空虚,右侧腹股沟疝内有两个球形物,右侧阴囊内有睾丸。     

2079例新生儿核型分析初步报道

新生儿染色体异常发生率的调查,国外已有八个用常规染色体技术、一个用 G 显带技术的调查资料。国内尚无报告。我们自1979年5月3日开始,用染色体 G 式显带技术对长沙市北区三个医院连续出生的新生儿脐血标本作了染色体检查,以探讨中国人群中染色体异常的发生率,至1981年5月19日止共完成2079人的检查,已肯定的染色体异常共15例。他们的核型见表1     

酵母双杂交技术分析耳聋基因功能的实验研究

目的在耳聋基因功能的蛋白质相互作用研究领域建立酵母双杂交实验技术，探讨第三代酵母双杂交系统在该领域的应用价值。方法利用第三代MATCHMAKER GALA酵母双杂交系统，以最常见的耳聋基因GJB2(Cx26)为诱饵，以人胎脑cDNA文库为猎物，钓取Cx26的相互作用蛋白质的阳性克隆，DNA测序阳性克隆并行生物信息学分析。结果从胎脑文库筛选到Cx26互作蛋白的56个阳性克隆，对其中26个克隆分析认定为11个独立克隆，DNA测序发现3个克隆是已克隆基因，8个克隆是新基因序列。结论第三代MATCHMAKER GALA酵母双杂交系统是筛选Cx26相互作用蛋白质的一个可靠的实验手段，酵母双杂交技术可用于耳聋基因的蛋白质功能研究领域。