内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体.方法eNOS的cDNA插入pcDNA3.1(-)中,进行DNA测序、酶切鉴定;插入片段用Xbal和AflⅡ双酶切后连接到pshuttle中,并予酶切鉴定;用P1-see I和I-ceu I双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体,通过PCR鉴定.结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统,并被目的基因的PCR鉴定证实.结论重组腺病毒表达载体构建正确,为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础.     

同种异体组织工程化软骨组织的免疫学差异

软骨损伤是临床常见疾病之一 ,需利用软骨或其他替代材料进行修复。目前可施行的多种治疗手段均不甚理想 :新鲜异体软骨组织和人工合成组织代用品均存在着组织相容性问题 ;自体软骨组织移植则必须以牺牲人体正常组织为代价 ,且供体来源有限 ,小块移植物还有易变形的问题。 2 0世纪 80年代 ,随着生物材料和细胞生物学的发展 ,组织工程技术得到迅速发展。Ｗａｋｉｔａｎｉ等[1] 于1989年用同种异体软骨细胞组织工程化技术成功修复了兔关节软骨表面缺损。组织工程技术为修复软骨病损提供了一个新思路 ,如何获取足够量的种子细胞是该技术的关键…     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

重组hTGF-β1基因转染人脂肪干细胞对其向软骨分化的影响

目的研究重组hTGF-β1腺病毒(AdhTGF-β1)转染人脂肪干细胞(ADSCs)对其向软骨分化的作用。方法重组AdhTGF-β1转染人ADSCs,对照组转染AdLacZ,腺病毒的量以200pfu/细胞计算,体外细胞团聚集连续诱导培养21d,酶联免疫吸附定量检测(ELISA)hTGF-β1蛋白的表达,然后分别从大体观察、组织学和II型胶原蛋白免疫组化的检测对形成组织进行评价。结果 hTGF-β1蛋白量在14d时达最高峰,随后逐渐降低。连续细胞团聚集诱导培养21d,细胞团收缩成近似小球形的组织块,外观成乳白色。HE染色可见细胞团外周为由数层扁平状成纤维样细胞组成的纤维软骨膜,下部区域有巢状软骨样细胞组成,有些区域可见软骨样细胞包埋在软骨陷窝内。Safranin'O染色显示,形成的软骨组织区域有被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌。而对照组苏木素-伊红染色观察见无软骨样组织形成或有向软骨分化现象。Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示实验组细胞团出现较明显的阳性染色区域,可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内。对照组Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示无明显的阳性染色区。结论重组hTGF-β1腺病毒转染人ADSCs诱导人ADSCs向软骨细胞表型分化形成软骨样组织,为hTGF-β1基因转染的人ADSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础。