组织工程化软骨组织形成的最佳细胞浓度和最佳形成时间的实验研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内形成的最佳细胞浓度和最佳形成时间。方法取贵州香猪部分耳廓软骨组织体外消化分离软骨细胞,与可注射性生物材料Ｐｌｕｒｏｎｉｃ混合形成复合物,浓度为１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０×１０６／ｍｌ,将细胞－生物材料复合物接种于猪自体腹外侧壁皮下。第６周取材,分别称重,并作ＨＥ、ＳａｆｒａｎｉｎＯ染色,评价软骨组织形成的最适细胞浓度。参考上述实验结果,制成最适软骨细胞－生物材料复合物,接种到猪自体腹外侧壁皮下,分别在接种后第１、３、６、９和１５周取材,大体观察,并作ＨＥ、ＳａｆｒａｎｉｎＯ染色,确定软骨组织形成的最佳时间。结果在动物自体内形成的软骨组织,与正常软骨组织有相似的组织学特性,形成软骨组织最适细胞浓度为５０×１０６／ｍｌ,最佳形成时间是第６周。结论成功地利用组织工程技术在具有免疫功能的自体动物体内形成了软骨组织,并确定了软骨组织形成的最佳细胞接种浓度和接种的软骨组织形成最佳时限。     

智能聚合物与人类软骨细胞相容性的实验研究

目的:研究改性后的医用聚丙烯材料的细胞毒性.方法:采用MTT法,对不同接枝率的复合智能聚合物与人类软骨细胞之间的细胞相容性进行了实验研究.结果:接枝率为46%的PP/NIPAAm膜,65%,106.7%及143%的PP/NIPAm/AAc/RDGS膜,均有较好的细胞相容性,结论:智能化改性后的聚丙烯膜具有广阔的应用前景.     

重组hBMP7基因转染成纤维细胞及其表达

目的 探讨重组骨形态发生蛋白-7腺病毒载体(AdCMV-BMP7)在人真皮成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 重组腺病毒载体AdcMV-BMP7经293细胞包装、扩增后，转染人真皮成纤维细胞。转染48h后以免疫组织化学、RT-PCR等方法检测hBMP7基因在人真皮成纤维细胞内的表达情况。结果 在合适的滴度下，重组腺病毒载体AdCMV-BMP7对成纤维细胞的增殖能力无明显影响。转染48h后免疫细胞化学显示已转染AdCMV-BMP7的成纤维细胞内有大量的hBMP7表达，RT-PCR也检测到特异的hBMP7基因片段的表达。结论 重组腺病毒载体AdcMV-BMP7能够被转导入成纤维细胞内。并稳定表达hBMP7。     

应用碱性成纤维细胞生长因子体外扩增猪耳软骨细胞老化的规律

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)体外扩增软骨细胞的老化规律。方法细胞取自猪耳弹性软骨,实验分两组:培养液含10μg/L b-FCF组(简称bFGF组),培养液无bF- GF组(简称对照组),分别收集两组多代细胞,按5×107个/ml浓度与30%Pluronic F-127/Ham’s F-12混合,按每一样本0.5 ml注射到猪自体皮下,8周后取材,从大体观察、称重及组织学染色,对再生的软骨组织进行评价。结果bFGF组和对照组从第3代开始均未能形成软骨组织,bFGF组第2代软骨细胞和原代比较,在两周内扩增70倍,是对照组的12.7倍,且体内能形成很好的软骨。结论应用bFGF体外扩增的软骨细胞在第3代开始老化,失去成软骨能力,种子细胞应取第2代,可兼顾适量细胞数与具备成软骨能力。     

自体组织工程化软骨组织在体内最佳形成时间的研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内最佳形成时间，为临床应用提供理论研究和参数。方法取猪耳廓软骨细胞，与可注射性生物材料PluronicF127混合形成浓度为50×10     

重组hTGF-β1基因转染的BMSCs在体内成软骨能力的初步研究

目的重组hTGF-β1腺病毒(adeno-hTGF-β1)转染的BMSCs在体内成软骨能力的初步研究,探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1转染猪BMSCs,酶联免疫吸附定量检测(ELISA法)重组腺病毒转染hTGF-β1蛋白的表达。然后消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs,均匀接种于圆盘状PGA支架上,对照组转染adeno-LacZ,然后植入裸鼠背部皮下,在植入后第3周取材,分别行大体观察、组织学、II型胶原免疫组化和蛋白聚糖含量检测对形成组织进行评价。结果 ELISA结果显示adeno-hTGF-β1转染的BMSCs,其hTGF-β1表达量是转染adeno-lacZ 的BMSCs 2.65倍( P0.05)。植入裸鼠体内后3周取材,实验组HE染色观察可见有软骨形成,但较不均匀,并被纤维组织分割,形成的软骨组织区域可见软骨细胞包埋在软骨陷窝内;对照组可见仅有少量软骨形成,被大量的纤维组织和未降解的PGA支架包裹,实验组和对照组形成软骨占总组织百分比,分别为(41.83±4.64)%和(17.50±2.85)%,P0.05。Safranin’O染色显示,实验组形成的软骨组织区域都有被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,着色比对照组更深。实验组形成的软骨组织区域有大量棕黄色的II型胶原颗粒,而对照组仅有少量的棕黄色的II型胶原颗粒,实验组形成的软骨组织中的蛋白聚糖含量多于正常猪耳软骨。结论重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs作为种子细胞,在裸鼠体内能促使软骨组织形成,从而为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础。     

胚胎来源的同种异体组织工程化软骨形成的研究

目的研究探讨同种异体组织工程化软骨在动物体内形成。方法取怀孕100d胚胎羊的关节软骨经体外制成细胞生物材料复合物,并注射到异体羊腹壁皮下,每隔2周取材,连续半年,对所取标本进行评价。结果在同种异体动物体内能形成软骨组织并与正常软骨组织有相似的组织学特性。第2、4周的软骨组织有一定程度的免疫排斥反应和炎症细胞浸润。第6周免疫反应减轻。结论应用组织工程技术可在同种异体动物体内再生软骨组织,再生的组织周围存在一定程度的免疫反应,随接种时间的延长而逐渐减弱。     

爱茜蓝法检测组织工程化软骨及软骨细胞中蛋白聚糖的含量

我们应用爱茜蓝法对生物样品中蛋白聚糖进行定量测定 ,判断组织工程化软骨的生化构成是否正常。一、材料与方法1.试剂 :盐酸胍 (ＧｎＣｌ)、爱茜蓝和ＴｒｉｔｏｎＸ 10 0购自上海生工公司 ;硫酸软骨素购自Ｓｉｇｍａ公司 ;其他常用化学试剂均为分析纯。2 .体外培养软骨细胞样本制备 :软骨细胞取自幼年长枫白猪耳软骨 ,Ｈａｍ’ｓＦ12 (Ｇｉｂｃｏ公司 ,含 10 %胎牛血清、30 0ｍｇ Ｌ谷氨酰胺、5 0ｍｇ Ｌ抗坏血酸、青、链霉素各 10 0Ｕ ｍｌ)体外培养。取对数生长期软骨细胞 ,调整密度至 1× 10 6 个溶于 5 0 μｌ裂解液 ( 5 0ｍｍｏｌ ＬＴ…     

b-FGF和TGF-β1对体外培养的软骨细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的软骨细胞增殖的影响。方法:细胞取自猪耳弹性软骨,体外培养原代至第6代软骨细胞,将培养液中加入TGF-β1或/和b-FGF作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨两种因子对软骨细胞增殖行为的影响。结果:b-FGF明显促进原代至第3代软骨细胞的增殖,并逐渐减弱,对第4代细胞无增殖作用,TGF-β1仅促进原代软骨细胞的增殖,TGF-β1和b-FGF联合应用,其刺激细胞增殖的作用明显低于b-FGF单一作用。结论:b-FGF显著促进体外培养的软骨细胞的增殖,主要作用于原代至第2代软骨细胞,明显强于b-FGF和TGF-β1联合应用。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用,为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的真核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组),RT-PCR、Northern-Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF-β1调节体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原表达的变化。结果:TGF-β1基因转染软骨细胞后,其Ⅱ型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且随着TGF-β1蛋白表达的丧失,其对软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论:TGF-β1可以上调体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。